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.2016年2月4日7:10612。
doi:10.1038/ncomms10612。

染色质相关降解由UBXN-3/FAF1定义，以保护DNA复制叉进展

安德烈·弗兰兹 1, 保罗·A·皮尔逊 1, Domenic Pilger公司 1 2, 斯瓦加塔·哈尔德 2, 迪维亚·阿楚汉库蒂 2, 哈米德·卡什卡 三, Kristijan斋月 2, 托尔斯滕·霍普 1
附属公司

染色质相关降解由UBXN-3/FAF1定义，以保护DNA复制叉进展

安德烈·弗兰兹等。 国家公社. .

勘误表in

摘要

DNA复制因子的协同活性是一个高度动态的过程，涉及泛素依赖性调节。在这种情况下，泛素导向的ATP酶CDC-48/p97最近成为确保基因组完整性的若干DNA代谢途径中染色质相关降解的关键调节因子。然而，染色质环境中不同CDC-48/p97底物的时空控制尚不清楚。在这里，我们报告DNA复制叉的进展是由UBXN-3/FAF1协调的。UBXN-3/FAF1结合许可因子CDT-1和其他泛素化蛋白，从而促进CDC-48/p97依赖的DNA复制因子复合物的周转和分解。因此，UBXN-3/FAF1失活使染色质上的CDT-1和CDC-45/GINS稳定，导致复制叉动力学严重缺陷，伴有明显的复制应激，最终导致基因组不稳定。我们的工作确定了一个关键的CDC-48/p97底物选择模块，该模块是秀丽隐杆线虫和人类染色质相关蛋白降解所必需的，与肿瘤发生和衰老相关。

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数字

图1
图1。对缺少CDC-48.1的蠕虫敏感ubxn-3型消耗。
(一)RNAi筛选程序的示意图，用于识别cdc-48.1型.野生型（wt）蠕虫（蓝色）和cdc-48.1（tm544）在分析胚胎致死性或发育性生长缺陷（用空平板表示）之前，通过RNAi去除缺失突变体（橙色）中的候选基因。通过延时显微镜分析细胞分裂缺陷的潜在相互作用基因。(b条,c（c）)Western blot分析小鼠胚胎提取物中CDC-48和微管蛋白水平，cdc-48.1型或cdc-48.2缺失突变体。图中显示了CDC-48相对于微管蛋白的水平。误差条显示了五个独立实验中产生的平均值的s.d。(d日)wt或cdc-48.1（tm544）通过RNAi去除胚胎中的指示基因。为了观察延长的三细胞期，胚胎分裂显示在AB细胞有丝分裂开始时（0秒）以及之前或之后的相应时间点（±450秒）。空箭头表示野生型的划分模式；填充的箭头表示P1单元的延迟单元分裂。比例尺，10μm。
图2
图2。UBXN-3的耗尽导致DNA复制应激。
(一)暴露于5 mM羟基脲（HU）后，蠕虫RNAi的发育缺陷耗尽了各自遗传背景中的指示基因。通过八个独立重复计算体重和体重的平均值cdc-48.1（tm544），或为cdc-48.2（tm659）误差条显示s.e.m.统计显著性指空的无HU（蓝色星号）或有5 mM HU（红色星号）的（RNAi）条件。(b条)npl-4（RNAi）具有指定基因型的蠕虫的敏感性。误差条显示s.e.m.平均值是通过四个独立的重复计算得出的。(c（c）)Western blot分析所示基因型同步化成虫的mCherry、UBXN-3和Tubulin蛋白水平。右边的星号表示mCherry:：UBXN-3融合蛋白。(d日)具有特定基因型的蠕虫对不同HU浓度的敏感性。图表显示了六个重复的平均胚胎死亡率。误差条显示s.e.m(e（电子）)RNAi控制缺失后的成人寿命(空的)或ubxn-3型有或没有10 mM HU。从五个重复中收集数据，总计表示每种情况下至少165个个体的平均寿命。在(一)单个星号表示P（P）值≤0.05，双星号≤0.001，三星号表示P（P）学生的值≤0.0001t吨-测试。在(e（电子）)双星号表示P（P）Mantel–Cox测试中的值≤0.01。
图3
图3。在缺乏UBXN-3和CDC-48.1的胚胎中，CDT-1和CDC-45/GINS积聚在有丝分裂染色质上。
(一)胚胎RNAi共聚焦z堆叠的代表性投影cdc-48.1（tm544）突变体。对胚胎进行RAD-51（绿色）和结合泛素（FK2）（红色）免疫染色。DNA用DAPI（蓝色）染色。方框区域放大三倍（×3缩放）。比例尺，10μm。(b条)单细胞期免疫染色cdc-48.1（tm544）突变胚胎RNAi缺失指示基因。CDT-1（绿色）、微管蛋白（红色）和DAPI（蓝色）染色显示为合并图像和独立通道。方框区域放大两倍（×2缩放）。空箭头表示wt-like CDT-1水平，填充箭头表示后期染色质中CDT-1增加。比例尺，10μm。(c（c）,e（电子）)延时录制的选定图像cdc-48.1（tm544）表达GFP:：CDC-45（绿色）或GFP:：SLD-5（绿色）的胚胎空的控制，ubxn-3型和npl-4型每个图像序列分别显示AB和P1细胞有丝分裂的代表性细胞周期阶段。空箭头表示野生型CDC-45和SLD-5定位，填充箭头表示指示蛋白与有丝分裂染色质持续结合。驾驶员信息中心（DIC）显示为灰色。比例尺，10μm。(d日,（f）)量化WB（蓝色）和P1细胞分裂（细胞周期延迟）之间的细胞延迟cdc-48.1（tm544）（橙色）胚胎耗尽空的,ubxn-3型和npl-4型通过RNAi。时间以秒为单位显示。对表达GFP:：CDC-45的胚胎进行细胞分裂时间评估(c（c）)和GFP:：SLD-5(e（电子）)分别是。误差条显示s.e.m.平均值基于每个条件的两到六个单独记录。
图4
图4。UBXN-3与CDC-48和CDT-1相互作用体内.
(一)细胞分馏秀丽线虫用免疫印迹法分析胚胎，分别检测CDC-48、UBXN-3、CDT-1、微管蛋白和组蛋白3。核部分未经处理或进行超声波处理，以从染色质中释放相关蛋白。(b条——d日)将wt蠕虫裂解物与与Dynabeads蛋白A偶联的指示抗体孵育以进行免疫沉淀，然后通过免疫印迹法分析CDC-48、UBXN-3和CDT-1。(e（电子）)通过RNAi对缺乏指示基因的胚胎裂解物进行Western blot分析。(（f）)RNAi显示基因缺失的单细胞期胚胎共焦图像的投影。对胚胎进行UBXN-3（绿色）免疫染色。DNA用DAPI染色（红色）。方框区域放大三倍（×3缩放）。箭头表示UBXN-3的核穿孔。比例尺，10μm。
图5
图5。UBXN-3结合域的功能分析。
(一)用于结合研究的全长UBXN-3、截短肽和FPK基序突变体的示意图。全长UBXN-3b由608个氨基酸（aa）组成。(b条,c（c）)将wt或NPL-4缺失的蠕虫裂解物与指示的、与Ni-NTA珠结合的重组UBXN-3变体孵育，并通过蛋白质印迹分析。通过免疫标记泛素结合物（FK2）、CDT-1和CDC-48检测洗脱蛋白。
图6
图6。人类细胞中DNA复制的调节是保守的，并且依赖于FAF1。
(一)转染有指定siRNAs的HEK293T细胞中磷特异性抗体对复制检查点激活的Western blot分析。(b条)DNA复制光纤分析示意图-（a）表示正在进行的复制（红色和绿色箭头），（b）暂停的复制分支（仅红色箭头），以及（c）新启动的源（仅绿色箭头）和（d）终止/聚合分支。分别标记DNA复制起始（I）或终止（T）的位点。(c（c）)用指示的siRNA转染的T24细胞裂解物的蛋白质印迹分析。FAF1蛋白水平显示了siRNA介导的缺失效率。(d日,e（电子）)显示siRNA转染后T24细胞中DNA复制纤维的分子结合显微分析的代表性图像。CldU（第一脉冲）合并显示为红色，合并IdU（第二脉冲）显示为绿色。在T24细胞中指示siRNA转染后复制DNA束长度的量化。根据每种情况和实验，测定100个单独叉子的牵引长度。实验重复了两次。晶须盒图显示了10-90百分位范围内的平均值和数据。(（f）——我)表明siRNA转染后，U2OS细胞中DNA复制纤维的分子结合显微分析的代表性图像。在U2OS细胞中显示siRNA转染后，对复制DNA束长度、停滞的复制叉和新激发的休眠起源进行量化。根据每种情况和实验，对100个叉子的拖拉机长度进行了测定。在每种条件和实验中，对400个叉子的叉子熄火和原点点火进行了量化。实验分三个重复进行。(j个)对照HA和HA-FAF1 co-IP的Western blot分析。从表达p97-E587Q变体的HEK细胞制备核裂解物。(k个)通过siRNA去除HEK细胞作为对照或FAF1。通过western blot分析在CHX治疗后的指定时间点监测CDT-1和PCNA水平。比例尺，5μm。数据显示平均值。错误条表示s.d.。单个星号表示P（P）值≤0.05，双星号≤0.001，三星号表示P（P）值≤0.0001。
图7
图7。UBXN-3/FAF1定义了染色质相关降解，以确保DNA复制叉的进展。
UBXN-3/FAF1在CDC-48/p97调节DNA复制中作用的假设模型。UBXN-3/FAF1（紫色）结合与染色质结合的泛素化CDT-1（绿色）并招募CDC-48/p97UFD-1/NPL-4型复合体（蓝色），用于26S蛋白酶体分解和随后的复制因子周转。染色质相关CDT-1的调节对于确保有效的DNA合成、保护细胞免受DNA复制应激至关重要。
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