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.2016年1月14日；164(1-2):69-80.
doi:10.1016/j.cell.2015.12.017。 Epub 2015年12月24日。

非编码RNA-NORAD通过对PUMILIO蛋白进行测序来调节基因组稳定性

Sungyul Lee先生 1, 弗洛里安·科普 2, 宗成昌 2, 阿努帕马·萨塔鲁里 2, 陈贝贝（Beibei Chen） 三, 苏珊玛·西瓦库玛 4, 余洪涛 5, 杨燮 6, 约书亚·T·门德尔 7
附属公司

非编码RNA NORAD通过保守PUMILIO蛋白调节基因组稳定性

Sungyul Lee先生等。 单元格. .

摘要

长非编码RNA（lncRNAs）已成为多种生物过程的调节器。在这里，我们描述了DNA损伤后诱导的一种特征不良的人类lncRNA（LINC00657）的初始功能分析，我们称之为“DNA损伤激活的非编码RNA”，即NORAD。NORAD高度保守且丰富，每个细胞的表达水平约为500-1000拷贝。值得注意的是，NORAD的失活在先前核型稳定的细胞系中引发了显著的非整倍体。NORAD通过隔离PUMILIO蛋白来维持基因组的稳定性，PUMILIO蛋白抑制与之结合的mRNA的稳定性和翻译。在没有NORAD的情况下，PUMILINO蛋白通过过度抑制有丝分裂、DNA修复和DNA复制因子来驱动染色体不稳定。这些发现介绍了一种调节高度保守和剂量敏感性RNA结合蛋白家族活性的机制，并揭示了lncRNA和PUMILIO蛋白在维持基因组稳定性方面的意外作用。

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数字

图1
图1。的特征诺拉德，一种由DNA损伤诱导的高度丰富、保守的哺乳动物非编码RNA
（A） 的示意图诺拉德（参考序列注释为LINC00657（链接0657）)与UCSC Genome Browser相关的轨迹描绘了哺乳动物保护（PhastCons）以及人类细胞系中ENCODE RNA-seq和H3K4me3 ChIP-seq覆盖率（Rosenbloom等人，2013）。（B） qRT-PCR分析诺拉德与18S rRNA相关的表达第53页+/+和第53页−/−HCT116细胞（Bunz等人，1998年），使用或不使用1μM阿霉素治疗24小时。对于本图和所有后续qPCR图，误差条表示3个独立测量值的标准偏差。（C） Northern印迹分析诺拉德HCT116细胞总RNA的表达。（D） 绝对量化诺拉德用qRT-PCR测定不同人类细胞系中每个细胞的转录副本数，用1μM阿霉素治疗或不治疗24小时。（E） CSF最高得分诺拉德以及通过PhyloCSF分析确定的其他已知编码和非编码RNA（Lin等人，2011年）。另请参见图S1。
图2
图2。基因失活诺拉德人类细胞染色体不稳定性的结果
（A）诺拉德使用自定义TALEN对（表示为剪刀）在基因的前300个核苷酸内裂解，从而刺激嘌呤霉素抗性盒（PuroR（右）)然后是串联聚腺苷化信号（STOP）。绿色三角形表示loxP站点。（B） Northern印迹分析诺拉德在指定基因型的HCT116克隆中。（C） 流式细胞术直方图显示了代表性二倍体和四倍体的DNA含量，如碘化丙啶染色所测诺拉德−/−HCT116克隆。（D） 野生型HCT116细胞和代表性四倍体和二倍体的中期扩散诺拉德−/−克隆。每张图片右下角的数字表示存在的染色体数量。红色显示异常染色体数。（E）7号染色体和20号染色体FISH的代表性图像诺拉德+/+和诺拉德−/−HCT116细胞。白色箭头突出显示染色体丢失或获得的细胞。（F）诺拉德−/−细胞非整倍体水平显著升高。使用DNA FISH对3个独立的敲除克隆中每个克隆的至少100个间期细胞核进行7号和20号染色体的检测，并对显示非模态染色体数的细胞频率进行评分**p<0.005，chi-square检验。（G） 有丝分裂的典型延时图像诺拉德+/+和诺拉德−/−HCT116细胞。时间戳指示经过的分钟数。（H，I）延时成像实验中显示有丝分裂错误的有丝分裂百分比的量化。数值代表了3个独立实验的平均值，每个实验每个基因型39–100个有丝分裂成像。误差线表示标准偏差*p<0.05**p<0.01，学生t检验。另请参见图S1、S2和S3。
图3
图3。染色体不稳定是由于诺拉德灭活
（A） 在AAVS1/PPP1R12C使用已发布的TALEN对进行基因座分析（Hockemeyer等人，2009年；Sanjana等人，2012年），并使用DNA FISH评估纯合靶向HCT116克隆的非整倍体频率，如图2E-F所示。n.s.，不显著（χ2检验）。（B） qRT-PCR分析诺拉德用对照（siNT）或诺拉德-靶向siRNAs。（C） siRNA转染HCT116细胞12天后的非整倍体，如图2E-F所示进行分析。每种情况下至少有200个细胞核被评分。通过X平方检验计算的P值。（D） 流式细胞术直方图显示用所示siRNAs转染后产生的代表性HCT116亚克隆中的DNA含量，如碘化丙啶染色所测。（E） qRT-PCR分析诺拉德中的表达式诺拉德+/+和诺拉德−/−具有或不具有腺病毒Cre感染的HCT116细胞。（F） 未经治疗或腺病毒核心感染产生的亚克隆诺拉德−/−如图2E-F所示，对HCT116细胞进行非整倍体评分。通过Student t检验计算的P值。
图4
图4。诺拉德与PUMILIO蛋白相互作用
（A） PUM1和PUM2的正反义蛋白质印迹分析诺拉德碎片下拉列表。GAPDH作为阴性对照。（B，C）用FLAG-PUM2（Hafner等人，2010）或内源性PUM2生成的PAR-CLIP数据中每个PUM2目标转录物的CLIP读取总数直方图（B）。数量诺拉德CLIP显示为括号中的红色文本。（D） PRE在诺拉德.ND、，诺拉德域。（E） 映射到的内源性PUM2（上部）或FLAG-PUM2（下部）PAR-CLIP簇的位置和读取深度诺拉德.黑色条，簇重叠PRE；灰色条，非PRE簇。另请参见图S4和S5以及表S1和S2。
图5
图5。染色体不稳定性诺拉德−/−细胞通过PUMILIO过度活动介导
（A–C）描述PUM2 CLIP目标行为的累积分布图，如Hafner等人和本研究所定义，与所示RNA-seq实验中的非PUM2靶点。Kolmogorov–Smirnov检验计算的P值表明，在所有测试数据集中，PUM2靶点均受到显著抑制。（D） 使用7/20号染色体FISH对PUM1和PUM2过表达克隆进行非整倍体分析，如图2E-F所示。每个克隆至少有200个细胞核被计分。n.s.，不重要*p<0.05**p<0.005***p<0.0005，χ2检验。（E，F）对所示基因型的细胞进行非整倍体分析，如（D）所示*p<0.05，学生t检验，比较诺拉德−/−;PUM1系列+/+;泵2+/+到诺拉德−/−;PUM1系列−/−;PUM2系列+/+或诺拉德−/−;PUM1系列+/+;PUM2系列−/−（G，H）用对照siRNA（siNT）或两组不同的靶向siRNA转染后，延时成像实验中显示有丝分裂错误的有丝分裂百分比的量化PUM1系列和PUM2系列。值表示每项实验每种条件下85–200个核分裂成像的3个独立实验的平均值。误差线表示标准偏差*p<0.05**p<0.01，学生t检验。另请参见图S6和S7以及表S3。
图6
图6。维持染色体稳定性所需的基因在诺拉德−/−和PUM1/2过度表达细胞
（A） 维恩图显示了在诺拉德−/−Hafner等人和本研究中确定的HCT116细胞（调整后的p值≤0.05；见表S3）和PUM2 PAR-CLIP靶点。（B） 193个PUM2 PAR-CLIP靶点的基因本体分析诺拉德−/−细胞，显示与有丝分裂、细胞周期、DNA复制和DNA修复有关的基因丰富。（C） PUM2 PAR-CLIP靶点的qRT-PCR验证，这些靶点在维持基因组稳定性方面具有已知作用（见表S4），并且在诺拉德−/−细胞符合RNA-seq。基因表达标准化为18S rRNA。所有显示的基因在诺拉德−/−细胞（p≤0.05，Student t检验）。（D） qRT-PCR显示了在PUM1-和PUM2-过度表达的HCT116细胞中显著下调的C组基因表达（p≤0.05，Student’s t检验）（另见图S7G）。另请参见图S7和表S4。
图7
图7。A类诺拉德-调节基因组稳定性的PUMILIO轴
由于PUMILIO结合位点的丰富和众多，诺拉德作为PUMLIO活性的有力负调节器。在没有这种lncRNA的情况下，PUMILIO被释放出来，高度抑制维持染色体稳定性和整倍体状态所必需的基因程序，包括有丝分裂、DNA复制和DNA修复所需的关键因子。
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中的注释

  • 非编码RNA：诱骗pumilio以保持基因组稳定性。
    兹洛托伦斯基E。 兹洛托林斯基E。 Nat Rev Mol细胞生物学。2016年2月；17(2):68. doi:10.1038/nrm.2016.5。Epub 2016年1月21日。 Nat Rev Mol细胞生物学。2016 PMID：26790530 没有可用的摘要。
  • 诺拉德：基因组的捍卫者。
    文丘拉A。 文丘拉A。 趋势Genet。2016年7月；32(7):390-392. doi:10.1016/j.tig.2016.04.002。Epub 2016年5月5日。 趋势Genet。2016 PMID：27157388 审查。

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