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.2016年1月；193(1):1-12.
doi:10.1016/j.jsb.2015.11.003。 Epub 2015年11月19日。

Gctf：实时CTF测定和校正

张凯（Kai Zhang） 1
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Gctf：实时CTF测定和校正

张凯（Kai Zhang）. J结构生物学. 2016年1月.

摘要

准确估计对比度传递函数（CTF）对于近原子分辨率低温电子显微镜（cryoEM）重建至关重要。这里，提出了一个GPU加速的计算机程序Gctf，用于准确、可靠的实时CTF测定。Gctf的主要目标是最大化模拟CTF与背景减影后观察显微照片的对数振幅谱（LAS）的互相关。Gctf中的新方法提高了速度和准确性。除了GPU加速（例如10-50×）之外，快速的“一维搜索加二维细化（1S2R）”程序进一步加快了Gctf。基于全局CTF确定，精确地细化了每个粒子和电影单帧的局部离焦，提高了后续图像处理中所有粒子的CTF参数。该程序还实现了使用等相平均（EPA）和自一致性验证程序的新型诊断方法，以供实际使用，特别是用于近原子重建的目的。Gctf是一个独立的程序，其输出可以很容易地导入其他低温EM软件，如Relion（Scheres，2012）和Frealign（Grigorieff，2007）。本文显示并讨论了几个典型数据集的结果。

关键词：CTF测定；对比度传递函数；冷冻电子显微镜；GPU程序。

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数字

图1
图1
CTF相位误差和离焦误差之间的关系。（a） 在300kV高压下，不同程度的离焦误差导致的CTF相位误差。灰色虚线表示90°相移标准的阈值。（b） 根据（a）中的90°标准，绘制了三个典型高压值（300 kV、200 kV和100 kV）在不同分辨率下允许的最大离焦误差。
图2
图2
Gctf流程图。
图3
图3
使用真实显微照片的Gctf流程图。提供了一张具有明显散光的显微照片，以清楚地展示手术过程。
图4
图4
同相平均值。（a） 背景还原后的对数振幅谱（LAS）。绿点是要平均的目标像素。红线表示此图像中绿点具有等相位的所有像素。（b） 典型的等相位平均LAS图像。已排除低于50º或高于7º的分辨率。
图5
图5
使用Gctf比较几个流行程序的速度。每个程序的所有参数都设置为默认值（由Relion调用的CTFFIND3/4）。由于程序之间的速度差异很大，因此多次使用不同数量的显微照片进行测试：CTFFIND3在一张显微照片上，CTFFIND 4、FASTDEF、ACE2在10张微观照片上，而Gctf在1000张显微照片中。Gctf运行在单个GTX 980 GPU上，其他程序运行在Intel Xeon E5-2643 v2 CPU上。
图6
图6
九个基准数据集的Gctf和CTFFIND3离焦差异统计。数字10是的图5中使用的dynactin数据集（Zhang，2015）。蓝色列表示平均差异；红色列表示中间的差异，这意味着在每个数据集中，50%的显微照片的差异低于或高于此值。
图7
图7
等相位平均，以便更好地诊断。（a） HAV（Dataset-8）典型低温EM显微照片的不同光谱图像，具有～1800º散光；左上：背景提取LAS；右上：圆形平均值；左下：等相平均值；右下：模拟。（b） 将区域从9º扩大到4º，以详细比较不同的诊断方法。三幅图像中左侧的通环代表模拟的振幅谱；右侧表示用不同方法显示的观测光谱。显然，即使在背景降低后，在高于9°时，原始光谱（i）中的通环也几乎不可见。在圆形平均（ii）之后，由于大的散光，环变得更清晰，但明显偏离了正确的峰值。有些环几乎是相反的对比，这表明圆形平均在这样的分辨率下是没有意义的。等相平均值（iii）使所有环在4℃以下清晰可见。
图8
图8
使用可变分辨率截止或估计像散作为输入进行CTF测定的稳健性测试。（a） 选择HAV的典型CryoEM显微照片并进行系统检查，以测试Gctf的稳健性。蓝色点表示高分辨率截止结果，红色点表示低分辨率截止结果。（b） 散光的输入值范围为10º至10000º，作为CTF测定的初始估计值。此范围内的所有输入值生成的结果几乎相同。因此，在这种情况下无需优化输入像散。蓝色和红色线条分别表示U和V散焦。绿线表示方位角。
图9
图9
电影单帧的CTF测定。（a） dynactin的平均影片（顶部）和单帧（底部）（数据集5）。电影拍摄于FEI Titan Krios，Falcon II探测器上，剂量为1.6 e/（λ2·框架）。（b） 使用平均影片（顶部）或单个帧（底部）确定CTF。对于这两幅图像，左侧是模拟CTF，右侧是观察LAS。确定的离焦(z（z）u个,z（z）v（v）,θast公司)平均电影为（41642.58°，41140.62°，61.67°），第一帧为（41711.86°，41196.36°，52.80°）。差值为（69.28°，55.74°，8.87°）。（c） 平均散焦的变化(z（z）u个+z（z）v（v）)/2随着显微照片上剂量的累积。与（b）略有不同的是，通过平均9个相邻帧（例如，第15帧为11–19）来确定每个帧的CTF，以提高信噪比。
图10
图10
显示局部CTF细化重要性的示例。（a） dynactin的原始显微照片（数据集-6）。（b） 通过Gctf确定的该粒子的局部散焦为3.92μm。红色箭头表示拟合在5Å以内几乎是完美的。黑色曲线表示粒子1的圆平均LAS；蓝色曲线表示与Gctf测定的比较。（c） 与（b）类似，但适用于粒子2。该粒子的离焦为3.87μm。CTF的安装也非常完美，最高可达5度。（d） 比较粒子1的圆平均LAS和使用粒子2散焦的模拟振幅谱。与（b）或（c）相比，模拟的CTF曲线不符合高分辨率下的观测曲线，这表明局部细化对于近原子分辨率重建的重要性。
图11
图11
全球和本地CTF之间的FSC比较。（a） 比较Dynactin FSC曲线（绿色）和不进行局部离焦细化（红色）。86916个粒子用于Dataset-7的最终重建。（b） HAV的FSC曲线比较（绿色）和（红色）进行局部离焦细化的情况。2025个粒子用于Dataset-8中的最终重建。
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