Physical Connectivity Mapping by Circular Permutation of Human Telomerase RNA Reveals New Regions Critical for Activity and Processivity

doi:10.1128/MCB.00794-15

.2015年10月26日；36(2):251-61.

doi:10.1128/MCB.00794-15。 2016年1月15日印刷。

人类端粒酶RNA环状排列的物理连接性绘图揭示了对活性和加工性至关重要的新区域

梅丽莎·梅福德¹, 大卫·C·扎普拉²

附属公司

PMID： 26503788
预防性维修识别码：项目经理4719293
内政部： 10.1128/立方米.00794-15

人类端粒酶RNA环状排列的物理连接性绘图揭示了对活性和加工性至关重要的新区域

梅丽莎·梅福德等。分子细胞生物学. 2015.

.2015年10月26日；36(2):251-61.

doi:10.1128/MCB.00794-15。 2016年1月15日印刷。

作者

梅丽莎·梅福德¹, 大卫·C·扎普拉²

附属公司

¹美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学生物系。
²美国马里兰州巴尔的摩市约翰斯·霍普金斯大学生物系zappulla@jhu.edu。

PMID： 26503788
预防性维修识别码：项目经理4719293
内政部： 10.1128/MCB.00794-15号

摘要

端粒酶是一种特殊的核糖核蛋白复合物，它延伸染色体的3'端以抵消端粒缩短。然而，端粒酶活性增加与～90%的人类癌症相关。端粒酶在体外的活性最低限度地需要RNA（hTR）和专门的逆转录酶蛋白（TERT）。了解hTR的结构-功能关系对人类疾病具有重要意义。我们首次使用循环排列测试了451核苷酸hTR RNA的物理连接性要求，该排列重新定位了5'和3'末端。我们广泛的体外分析确定了三类功能改变的hTR环状置换物。首先，模板的3’循环排列导致重复加成过程中的特定缺陷，表明纤毛虫中发现的模板识别元件在人类端粒酶RNA中是保守的。其次，位于催化重要核心和CR4/5结构域中的7个循环排列完全消除了端粒酶活性，揭示这些领域的机械关键部分。第三，核心和CR4/5之间的几个圆形排列显著增加了端粒酶活性。我们广泛的环状排列结果为人类端粒酶RNA的结构和协调提供了深入的见解，并突出了RNA可作为抗衰老和抗癌治疗药物开发的靶点。

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数字

图1
模板的环形排列3′在重复添加过程中造成特定缺陷。（A） hTR结构示意图，说明保守核心、CR4/5和scaRNA结构域。指示野生型5′端和3′端融合的位置（虚线）。（B）模板（装箱）和与端粒DNA底物引物结合的相邻3′区域的序列。以下是圆形渗透体中重新定位端的位置。序列替换是小写的。（C）体外端粒酶活性测定显示模板（如上）的3′环状排列。相对活性分为以下几类：-，无可检测的端粒酶活性，～0%；+，低但可检测的活性，<～50%；++，轻微抑制活性，>～50%；+++，野生型活性，～100%；++++，大于野生型活性，>～100%。带有重复添加过程缺陷的圆形渗透体用“r”表示[³⁵S] 蛋氨酸标记的hTERT如下所示。

图2
整个假结的圆形排列引起广泛的表型。（A）显示了hTR的二级结构和假结区。（B）假结的详细结构，基于先前发表的研究（35）。显示野生型核苷酸编号。圆形排列由箭头表示，并由新5′端的相应核苷酸命名。（C）体外端粒酶检测显示出不同程度的活性。LC，内部放射性标记回收和装载控制。活动水平如图1所示。免疫纯化[³⁵S] 蛋氨酸标记的FLAG-hTERT如下所示。如虚线所示，将通道1至14和通道15至18中的蛋白质样品平行放置在两个单独的凝胶上。

图3
CR4/5结构域中的多个环状排列完全消除了端粒酶活性。（A） hTR的二级结构突出显示CR4/5区域（灰色框）。（B）标记野生型核苷酸编号的CR4/5区序列。（C）体外进行端粒酶活性测定，相对活性如图1所示。虽然在这个实验中CP266基本上没有端粒酶活性，但一个生物复制品表明其检测到的活性非常低。通道1至7中的数据来自相同的凝胶，虚线表示一些中间的通道被裁剪出来。车道8和9在另一个凝胶上运行，虚线同样表示车道被裁剪出来。[³⁵S] 下面显示了从每个检测的端粒酶制剂中提取的蛋氨酸标记的免疫纯化hTERT。

图4
5′端和scaRNA结构域中的几个环状突变导致端粒酶活性增加。（A）感兴趣区域框中的hTR结构。（B） 5′末端和scaRNA区域的序列。显示野生型核苷酸编号。（C）体外端粒酶活性测定。相对端粒酶活性如图1所示。通道7至14中的数据在相同的凝胶上运行；虚线表示从凝胶中裁剪出中间车道的位置。下面是免疫净化[³⁵S] 蛋氨酸标记的hTERT。

图5
人类端粒酶RNA循环排列揭示了结构与功能的相关性。描述了451-核苷酸hTR的序列。位置1和451之间的虚线表示圆形渗透体中的连接端。每个圆形排列等位基因表型由一个箭头指示，箭头指向重新定位的5′端和3′端的位置。箭头的颜色表示相对活动箱。

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