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.2015年8月21日；290(34):20995-21006.
doi:10.1074/jbc。M115.675835。 Epub 2015年7月6日。

泛素与FANCL E2样折叠结构域相互作用调节范科尼贫血DNA修复途径

詹妮弗·A·迈尔斯 1, 马克·G·弗罗斯特 2, 艾利斯·卡罗尔 三, 米歇尔·罗伊 4, 马克·霍华德 4, 阿提什·西德胡 1, Viduth K Chaugule公司 2, 阿诺·F·阿尔皮 5, 海伦·沃登 6
附属公司

泛素与FANCL E2样折叠结构域相互作用调节范科尼贫血DNA修复途径

詹妮弗·A·迈尔斯等。 生物化学杂志. .

摘要

范科尼贫血（Fanconi Anemia，FA）DNA修复途径对DNA链间交联（ICL）的识别和修复至关重要。这些ICL的无效修复可能导致白血病和骨髓衰竭。该途径中的一个关键步骤是通过环E3连接酶FANCL使FANCD2单泛素化。FANCL由3个结构域组成，一个与E2结合酶相互作用的环结构域，一个底物相互作用所需的中心结构域，以及一个N末端类E2折叠（ELF）结构域。ELF结构域存在于所有FANCL同源物中，但该结构域的功能尚不清楚。我们在此报告，FANCL的ELF结构域需要介导FANCL和泛素之间的非共价相互作用。这种相互作用涉及泛素上的经典Ile44补丁和FANCL上的功能保守补丁。我们表明，相互作用对于识别核心复合物不是必需的，它不会增强FANCL和Ube2T之间的相互作用，并且对于体外FANCD2单泛素化也不是必需的。然而，我们证明ELF结构域是促进脊椎动物细胞中高效DNA损伤诱导的FANCD2单泛素化所必需的，这表明FANCL在体内具有重要的泛素结合功能。

关键词：DNA修复；E3泛素连接酶；等温滴定量热法（ITC）；核磁共振；结构；泛素。

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数字

图1。
图1。
FANCL通过N末端E2样折叠结合泛素。 A类，泛素对FANCL物种的下拉表明泛素结合是由ELF结构域介导的。每个实验都用抗His-ubiquitin和抗FANCL抗体进行探测，并指示输入、诱饵和珠子对照。B类等温滴定量热曲线显示ELF结构域与泛素的结合。指出了相互作用的解离常数和化学计量比。
图2。
图2。
的结构分配果蝇属ELF域。 A类，ELF域的叠加果蝇属FANCL输入蓝色（PDB 3K1L）（19），E2 Ube2L3英寸黄色的（PDB 1FBV）（48）。E2蛋白-蛋白质相互作用表面表明，Ube2L3的催化半胱氨酸的位置也是如此。B类，分配果蝇属ELF域1H（H）-15N HSQC。中的交叉峰1H（H）-15N HSQC被分配给果蝇属ELF域。
图3。
图3。
FANCL ELF结构域和泛素的相互滴定表明这两种蛋白质之间的相互作用。 A类,15N个-1H HSQC15野生型泛素滴定过程中N标记的ELF结构域。野生型ELF域谱表示为黑色，ELF为5:1到泛素蓝色和1:1英寸红色. The箱是部分光谱的缩放。B类,15N个-1的H HSQC15野生型ELF滴定过程中的N-标记泛素。野生型泛素光谱黑色，其中泛素与ELF的比值为5:1蓝色和1:1英寸红色. The箱是部分光谱的缩放。
图4。
图4。
ELF结构域上的溶剂暴露补丁与泛素的疏水性Ile44补丁相互作用。 A类，ELF结构域在滴定未标记泛素时光谱中交叉峰位移的图形表示。B类，在滴定未标记ELF域时泛素光谱中交叉峰位移的图形表示。这个年轴表示野生型之间每个残留物的交叉峰高减少百分比1H（H）-15N HSQC和1H（H）-15N HSQC记录为5:115N标记蛋白质。C类，的功能区图果蝇属ELF域（in紫色)和泛素（in蓝色)与结合有关的残基突出显示在红色.D，的曲面表示果蝇属ELF域（in紫色)和泛素蓝色)与结合有关的残留物如所示红色.
图5。
图5。
ELF结构域的突变消除了结合。 A类ITC曲线显示泛素和L81R ELF结构域之间缺乏相互作用。B类ITC曲线显示ELF结构域和I44A泛素之间缺乏相互作用。C类,1H（H）-15野生型DmELF域的N个HSQC谱(蓝色)覆盖着1H（H）-15DmELF-L81R的N HSQC光谱(红色). 覆盖图显示两种蛋白质的结构、折叠和稳定性具有可比性。这个插入显示了这些实验中使用的考马斯染色蛋白质凝胶。
图6。
图6。
泛素结合在脊椎动物中是保守的。 A类，各种FANCL ELF域的基于结构的对齐：黑腹果蝇（Dm）、人类（Hs）、小鼠（Mm）、鸡（Gg）、，热带爪蟾（Xt），和达尼奥雷里奥（博士）。对保存的残留物进行阴影处理红色，中的保守替换橙色，中的半保守替换黄色的泛素结合相关的残留物包括装箱的，Leu-81/Asn-72残基标记为星号结构元件包括在序列上方。B类，的下拉菜单热带非洲爪蟾泛素结合的FANCL表明泛素结合是保守的。每个实验都用抗His-ubiquitin和抗FANCL抗体进行探测，并指示输入、诱饵和珠子控制。
图7。
图7。
E2识别不需要泛素结合。 A类，野生型与L81R相互作用的下拉分析果蝇属FANCL和人类Ube2T或Ube2T-Ub。两个FANCL物种都在相同程度上结合了Ube2T和Ube2T-Ub。B类Ube2T自身泛素化的Western blot分析果蝇属FANCL WT、L81R和ΔELF物种。E3的所有变体都能成功刺激泛素从Ube2T释放到自身。C类，凝胶内荧光分析在体外FANCD2单泛素化(左边). 泛素被荧光标记，没有ATP和E3控制，显示FANCD2的修饰。这个右侧面板图中显示了5个独立的重复，采用考马斯染色的负荷控制，并量化了FANCD2泛素化水平(底部).
图8。
图8。
脊椎动物细胞中高效的FANCD2/FANCI单泛素化需要FANCL的泛素结合。 A类,FANCL公司-DT40细胞缺陷（fancl−/−)用TAP标记的野生型FANCL（TAP-FANCL）和具有突变ELF泛素结合位点的FANCL进行补充（TAP-PANCL（L7A，L79A）、TAP-FANCL（L7 A，D78A，L79 A，V80A）、TAP-FANCL（L7A，D78R，L79A））。细胞为150 n米MMC处理的（+）或模拟处理的（−），裂解物被细分为高盐核提取物(NEX公司)和可溶性染色质提取物(CHEX公司). 在SDS-PAGE凝胶上分离等量的总蛋白提取物，并使用抗FANCD2和抗TAP抗体进行免疫印迹分析。ELF泛素结合位点的突变扰乱了MMC诱导的FANCD2单泛素化。D2-Ub，单泛素化FANCD2；D2，未修改的FANCD2。B类，单泛素化的FANCD2和未修饰的FANCD2的各种比率的定量，如A类使用ImageJ分析软件。平均值的标准误差来自三个独立的实验。C类，中描述的细胞株A类暴露于150 ng/ml MMC，在指定时间后制备全细胞提取物，并进行FANCD2免疫印迹分析。D类，单泛素化FANCD2和未修饰FANCD2的各种比率的定量，如C类使用ImageJ分析软件。D类，指示细胞系用600 n米MMC（+）或模拟处理（−），按照A类用抗FANCI和抗TAP进行免疫标测分析。ELF突变细胞中FANCI单泛素化显著降低。I-Ub公司，单泛素化FANCI；我，未修改的FANCI。F类用IgG-Sepharose从相应的DT40细胞中亲和纯化TAP标记的野生型FANCL（TAP-FANCL）和ELF-突变的FANCL(重量)或I44A突变的HA泛素（I44A）。泛素形式的共沉淀用抗HA免疫标测分析。突变ELF结构域或泛素I44疏水性斑块会破坏TAP-FANCL泛素相互作用。G公司用Superose 6尺寸排阻色谱对TAP-FANCL和TAP-FANCL（L7A D78R L79A）高盐核提取物进行分级，并用抗TAP免疫标测分析组分。野生型FANCL和ELF结构域突变的FANCL之间的1–1.5 MDa复合物洗脱曲线具有可比性。
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