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.2015年6月10日；334(2):283-93.
doi:10.1016/j.yexcr.2015.04.014。 Epub 2015年4月29日。

人类DNA解旋酶B与复制起始蛋白Cdc45相互作用，促进Cdc45与染色质的结合

珍妮·格哈特 1, 古尔芬·D·古勒 2, 埃伦·范宁 2
附属公司

人类DNA解旋酶B与复制起始蛋白Cdc45相互作用并促进Cdc45与染色质的结合

珍妮·格哈特等。 Exp单元Res. .

摘要

真核细胞中的染色体DNA复制始于复制起始位点，以G1早期复制前复合物的组装为标志。在G1/S转变时，补充额外的复制起始蛋白可以使DNA聚合酶的起源DNA解链和加载。我们发现，人类DNA解旋酶B（HDHB）的缺失会抑制DNA复制的启动，这表明HDHB在DNA合成的开始中发挥了作用。为了深入了解HDHB在复制起始期间的功能，我们检测了纯化的重组HDHB与关键起始蛋白的物理相互作用。HDHB直接与两个起始因子TopBP1和Cdc45相互作用。此外，我们发现HDHB的N末端和解旋酶结构域都与Cdc45的N末端结合。此外，人类细胞中HDHB的缺失减少了Cdc45与染色质的关联，表明HDHB可能促进人类细胞G1/S处Cdc45的募集。

关键词：Cdc45；DNA复制起始；人类DNA螺旋酶B。

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数字

图1
图1。HDHB-depleted细胞无法启动DNA复制
（A） 顶部；HDHB的功能区。N末端结构域（NTD）未经特征化。中心域（灰色）（残基467-926）包含七个超家族I解旋酶基序。C末端结构域包含一致的CDK磷酸化位点（垂直黑条）和亚细胞定位域（SLD），它们共同构成磷酸化依赖的亚细胞定位结构域（PSLD）[46]。显示了短发夹（sh）RNA shHDHB3和shHDHB4序列的位置。下方：；western blot分析表达shHDHB3、shHDHB4或shNON的U2OS细胞中HDHB的蛋白水平。图表；Western blot通过ImageJ64程序定量，并计算每个细胞系的条带强度百分比。将共表达GFP和shHDHB3或shNON的（B，C）U2OS细胞与BrdU孵育45分钟，用抗BrdU抗体染色，并用间接免疫荧光显微镜和差示干涉对比（DIC）检测。比例尺，15μm。（C） 显示了在两个独立实验中表达shNON（n=82）和shHDHB3（n=78）的BrdU染色细胞的比例。括号表示标准偏差。（D） 同步于G1、S和G2/M的U2OS细胞在固定前与BrdU孵育45分钟，用Mcm3和BrdU特异性抗体染色，并用间接免疫荧光观察。比例尺，15μm。表达shHDHB3或shNON的（E，F）U2OS细胞与BrdU孵育45分钟，用间接免疫荧光法观察BrdU和Mcm3。比例尺，15μm。（F） 在两个独立的实验中测定了（E）中BrdU-、Mcm3/和双阳性细胞的比例。
图2
图2。HDHB与TopBP1和Cdc45相互作用在体外
（A） 使用非免疫大鼠IgG（2、5、8道）或抗HDHB 5c9单克隆抗体（3、6、9道），从杆状病毒感染的昆虫细胞共同表达HDHB和Mcm4、Orc2或TopBP1的提取物中免疫沉淀HDHB。用western blot检测共沉淀蛋白，抗体显示在每个面板的右侧。平行电泳感染仅表达Mcm4（1区）、仅表达Orc2（4区）或同时表达HDHB和TopBP1（7区）的杆状病毒细胞的提取物样品。星号：部分降级的Mcm4（车道1）。（B） 通过SDS-PAGE和考马斯染色观察纯化的细菌表达的Cdc45（1区）、纯化的杆状病毒表达的HDHB（2区）和TopBP1（3区）。在不存在（泳道5、8）或存在纯化的HDHB（泳道6、9）的情况下，将预结合到多克隆HDHB抗体的蛋白A-琼脂糖珠与纯化的TopBP1或Cdc45孵育。TopBP1和Cdc45输入的样本（20%）显示在通道4和7中。用SDS-PAGE和western blot分析沉淀蛋白和指示抗体。
图3
图3。Cdc45的N末端与HDHB的N-和解旋酶结构域发生物理相互作用
（A） 通过SDS-PAGE和考马斯染色测定Ccd45的GST N-（aa 1-303）和C末端（aa 304–566）的表达水平。（B） GST下拉实验；HDHB被添加到Ccd45的GST N-（aa 1–303）和C末端（aa 304–566）。通过SDS-PAGE和western blot分析沉淀蛋白和指示抗体，GST或HDHB抗体。（C） GST下拉实验；HDHB——含有His-tag的N末端（aa 1–393）、解旋酶结构域（aa 394–958）或C端（aa 957–1088）被添加到Cdc45的GST N末端。用SDS-PAGE和western blot分析沉淀蛋白和指示的抗体，无论是His-taq还是GST抗体。
图4
图4。HDHB-depleted细胞中Cdc45染色质负载减少
（A） 如图所示，使用（+）或不使用（−）50μM罗斯柯夫汀（Ros）培养的U2OS细胞与BrdU孵育30分钟，使用标准方案（−SDS）固定和渗透，并用抗BrdU和抗细胞周期素E染色以进行免疫荧光显微镜检查。比例尺，70μm。（B） 培养的U2OS细胞（+或-如图所示）用1%甲醛固定10分钟，用0.1%Triton X-100和0.02%SDS[49,59]萃取，并用抗细胞周期素E和抗Cdc45染色，用于免疫荧光显微镜。（C） 通过计数每种培养物中100个DAPI染色的细胞，测定经+或-罗斯科汀处理并按（B）染色的培养物中Cdc45阳性细胞核的比例。共同表达GFP和shNON或shHDHB3的（D，E）U2OS细胞如（B）所示固定和渗透，并用Mcm3、TopBP1和Cdc45抗体染色。细胞核用DAPI染色。比例尺，15μm。（E） 在两个独立的实验中测定了表达shNON（n=190）或shHDHB3（n=183）的Cdc45阳性细胞的分数。括号表示标准偏差。表达对照（shNON）或HDHB shRNA（shHDHB3和shHDHB4）的（F，G）细胞被分为可溶性（F）和染色质（G）提取物，并用所示抗体进行western blot分析。
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