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.2015年4月13日；209(1):59-72.
doi:10.1083/jcb.201408079。

二硫键在皮肤角质形成细胞角蛋白中间丝组织和动力学中的作用

夏峰 1, 皮埃尔·A·库仑 2
附属公司

二硫键在皮肤角质形成细胞角蛋白中间丝组织和动力学中的作用

夏峰等。 J细胞生物学. .

摘要

我们最近报道了一种涉及角蛋白14（K14）中Cys367的反式二聚体、同型二硫键发生在相互作用的K5/K14 2B结构域的原子再溶结构和角蛋白细胞系中。在小鼠皮肤角质形成细胞的原代培养中，我们发现K14和K5蛋白池中有相当大一部分参与了角蛋白间二硫键的结合。通过比较野生型K14及其完全无半胱氨酸变体的性质，我们发现K14依赖性二硫键限制了体外聚合过程中纤维的伸长，但对于角蛋白丝的核周浓缩网络、正常角蛋白循环、，通过活体成像研究角质形成细胞中细胞核和整个细胞的固定行为。当分析在367位含有单个Cys残基的K14变异体时，这些表型中的许多被拯救。这些发现确立了二硫键作为一种新的重要机制来调节皮肤角质形成细胞中含有K14的中间丝的组装、细胞内组织和动力学。

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图1。
图1。
原代培养野生型新生小鼠皮肤角质形成细胞中K5和K14二硫键的患病率。（A） 免疫印迹分析显示K5和K14表位存在多个二硫键物种。M、 角蛋白单体；D、 角蛋白二聚体种类。星号表示抗K14抗体与K5的交叉反应性。（B） 使用洗涤剂萃取和Western免疫印迹分析法分析含有二硫键合K5-和K14-的物种的溶解度。Sol，Triton-soluble分数；Ins，Triton不溶性部分。（C） 低钙和高钙培养条件下小鼠角质形成细胞角蛋白（绿色通道）和二硫化物（红色通道）的免疫荧光成像。中间和底部的行显示了顶行中装箱区域的放大视图。最下面一行显示了K5/K14特异性信号与二硫键的全局信号之间的空间重叠。S-S，二硫键。箭头显示了核周区K5/K14和S-S之间的共定位。箭头表示单元-单元界面的同位化。棒材，10µm。
图2。
图2。
通过体外K14依赖的分子间二硫键的形成限制纤维伸长。（A） 半胱氨酸残基在人K5和K14蛋白中的定位。（B） 几种哺乳动物K14序列的比对：智人（NP_000517），Bos金牛座（NP_001160047），家犬（NP_001240670），小家鼠（NP_058654），以及褐家鼠（NP_001008751）。半胱氨酸残基以黄色突出显示。（C） 角蛋白组件的高速沉淀（150000克，30 min），然后对上清液（Sup）和颗粒（Pel）馏分进行还原SDS-PAGE分析。K14WT和K14CF在氧化缓冲条件下与K5WT共组装时，组装效率不同。黑线表示中间车道已拼接。（D） 通过基于密度计的上清液（S）和颗粒（P）组分分析定量灯丝组装效率，如C中所述。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。（E） 阴性染色和透射电子显微镜显示了含有K14WT-和K14CF的细丝在氧化环境中以及在组装后阶段暴露于还原环境时的结构特征。条形，100 nm。（F） 在氧化缓冲条件下组装时灯丝长度的测量。数据来自三个独立的实验。每次实验至少测量100根细丝。误差线代表SD。（G）K5/K14WT和K5/K14 CF在不同缓冲条件下的体外组装数据汇总。“极短IF”小于150 nm，“短IF”为200–500 nm，“中间IF”为500–1000 nm，“长IF”大于1µm。
图3。
图3。
核周角蛋白网络的形成和/或维持受到K14结合半胱氨酸和/或二硫键缺失的影响。（A） 免疫荧光成像揭示了原代培养中含有K14的纤维网络的三种不同的组织模式Krt14号机组−/−转染GFP-K14WT或GFP-K14 CF的小鼠角质形成细胞：“泛细胞质”、“核周浓缩”和“外周”IF网络。棒，10µm。（B） 如A所示，每种类型中频网络的频率。数据以三个独立实验的平均值±标准差表示。（C） 通过比较表达GFP-K14WT和GFP-K14 CF（绿色通道）的角质形成细胞的实时电影记录的静态图像。H2B-mCherry（红色通道）被联合转染以观察细胞核。所示图像对应于使用激光扫描共焦显微镜（参见视频1和2). N、 核心。棒，10µm。（D） 在第0、3和6小时的z堆叠图像的2.5维视图中，转染角质形成细胞的细胞质（绿色通道）和H2B-mCherry标记的细胞核（红色通道）中含有GFP-K14WT或GFP-K14 CF网络。
图4。
图4。
年核周围集中网络的部分救援Krt14号机组−/−角质形成细胞转染K14CF-C367。（A） 免疫荧光成像显示，GFP标记的K14C367A和K14CF-C367的过度表达导致角蛋白纤维网络组织的三种模式Krt14号机组−/−原代培养的小鼠角质形成细胞。棒，10µm。（B） 如A所示，每种类型中频网络的总体频率。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。（C） 表达GFP-K14CF-C367（绿色通道）的活小鼠角质形成细胞的视频记录的静态荧光图像。H2B-mCherry（红色通道）被联合转染以观察细胞核。显示了0到6小时的七个时间点（参见视频4和5). 最大强度投影确定了表达GFP-K14CF-C367的两个不同的小鼠角质形成细胞群体：有（w/periN）或无（w/o periN）核周浓缩网络（分别为45%和55%）。棒，10µm。（D） 与时间0、3和6 h的二维图像相对应的z堆叠图像的2.5维视图（以C为单位）。
图5。
图5。
K14CF-C367介导的二硫键的形成在体外产生直径较大的异常IFs。（A） 高速沉淀分析（150000克，30 min），然后对上清液（Sup）和颗粒（Pel）组分进行SDS-PAGE分析。在还原和氧化缓冲条件下，K14CF-C367与K5WT共组装。（B） 使用基于密度计的A中相应部分的分析定量灯丝组装效率。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。（C） 负染和透射电镜显示，K14CF-C367纤维在氧化缓冲液条件下的异常形态，在组装后的还原环境中可以恢复。条形，100 nm。（D） K5/K14CF-C367在各种缓冲条件下的体外组装数据汇总。短IFs，200–500 nm；中间IFs，500–1000 nm；长IF，>1µm；正常直径，8–12nm；宽直径，>13 nm。（E） 氧化缓冲条件下组装的含有K14的细丝的WT、无半胱氨酸（CF）和CF-C367的形态。顶部一行显示了反应完成后完整组件的负染示例，而中间一行和底部一行分别是高速沉降分析后上清液部分的负染实例和环氧树脂包埋颗粒部分的横截面。高速钢，高速沉淀。条形，100 nm。（F） 测量HSS封装IF对应的横截面灯丝直径（E中的最下面一行）。K14WT和K14CF测量了50多个横截面IF，K14CF-C367测量了100多个横截IF。P＜0.0001（***）。
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