Locus-specific targeting to the X chromosome revealed by the RNA interactome of CTCF

doi:10.1016/j.molcel.2014.12.006

.2015年1月22日；57(2):361-75.

doi:10.1016/j.molcel.2014.12.006。 Epub 2015年1月8日。

CTCF的RNA相互作用组揭示X染色体的位点特异性靶向

附属公司

¹霍华德·休斯医学研究所；美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院分子生物学系，邮编02114；美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院遗传学系，邮编02115。
²霍华德·休斯医学研究所；美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院分子生物学系，邮编02114；哈佛医学院遗传学系，美国马萨诸塞州波士顿02115；哈佛大学分子与细胞生物学系，美国马萨诸塞州剑桥市，邮编02138。
^三霍华德·休斯医学研究所；美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院分子生物学系，邮编02114；哈佛医学院遗传学系，美国马萨诸塞州波士顿02115；美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院病理科，邮编02114。电子地址：lee@molbio.mgh.harvard.edu。

PMID： 25578877
预防性维修识别码： PMC4316200型
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2014.12.006

CTCF的RNA相互作用组揭示X染色体的位点特异性靶向

约翰尼·特贡等。摩尔细胞. 2015.

.2015年1月22日；57(2):361-75.

doi:10.1016/j.molcel.2014.12.006。 Epub 2015年1月8日。

附属公司

¹霍华德·休斯医学研究所；美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院分子生物学系，邮编02114；美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院遗传学系，邮编02115。
²霍华德·休斯医学研究所；美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院分子生物学系，邮编02114；哈佛医学院遗传学系，美国马萨诸塞州波士顿02115；哈佛大学分子与细胞生物学系，美国马萨诸塞州剑桥市，邮编02138。
^三霍华德·休斯医学研究所；美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院分子生物学系，邮编02114；哈佛医学院遗传学系，美国马萨诸塞州波士顿02115；美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院病理科，邮编02114。电子地址：lee@molbio.mgh.harvard.edu。

PMID： 25578877
预防性维修识别码： PMC4316200型
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2014.12.006

摘要

CTCF是一个在基因组结构和基因表达中起重要作用的主调节器。目前尚不完全了解如何以特定于当地的方式招募CTCF。来自表观遗传过程的证据，如X染色体失活（XCI），表明CTCF在功能上与RNA相关。利用全基因组方法研究其RNA相互作用组和表观基因组景观之间的关系，我们报告了CTCF结合小鼠胚胎干细胞中数千个转录物，许多与CTCF的基因组结合位点非常接近。CTCF是一种特异的高亲和力RNA结合蛋白（Kd<1 nM）。在XCI期间，CTCF差异地结合活性和非活性X染色体，并直接与Tsix、Xite和Xist RNA相互作用。Tsix和Xite RNAs将CTCF靶向X失活中心，从而诱导同源X染色体配对。我们的工作阐明了CTCF以位置特异性方式招募的一种机制，并暗示了CTCF-RNA在长距离染色体相互作用中的相互作用。

PubMed免责声明

数字

**图1。CTCF-RNA相互作用组**
另请参见表S1-S2和图S1-S4。**（A）**在指定的基因组区域中，d0 mESC的总CTCF、正CTCF和反CTCF CLIP峰值的百分比。**（B）**3-kb原基因（RefSeq基因）±1 kb侧翼区域上的平均d0 CLIP峰值分布。**（C）**d0 CLIP峰值的平均轮廓在TSS和TTS的±4 kb范围内。**（D）**比较CLIP-seq和输入RNA-seq覆盖率的散点图。d3数据。输入RNA是根据RNA-seq数据组装而成的。对于CLIP-seq，将每个转录本内所有峰值的覆盖范围相加，以划分转录本长度。红色对角线，x=y。皮尔逊相关第页= 0.287,第页= 2.94×10^-178.（E）比较d3 CTCF CLIP（红色）和ChIP（蓝色）峰的Metagene图谱。**（F）**相对于CLIP峰，d3 ChIP峰的平均轮廓。CLIP-seq峰值在x轴上以nt 0为中心。

**图2。CTCF的RNA相互作用组和表观基因组景观**
另请参见表S1-S2和图S4和S6。标准化的CTCF CLIP-seq、ChIP-seque和RNA-seq信号**（A）** *Sox2系统*,**（B）** *斯里兰卡*,**（C）** *Jpx（像素）*,**（D）** 锡特和5'端*Tsix公司*、和**（E）**5'端*西斯特*。在每个CLIP和ChIP轨迹下面都是相应的统计显著“峰值”。红色虚线表示内部的重复图案*西斯特/尖峰*.P1和P2，两个*Xist公司*发起人。+，Watson链；-，克里克链。

**图3。X染色体上CTCF的等位基因特异性结合**
另请参见图S4-S5。第3天CTCF ChIP峰值、CLIP峰值和RNA-seq信号**（A）**X染色体，**（B）** *丹麦马克6a*、和**（C）** *中部1*仅显示了具有统计意义的ChIP和CLIP峰值。复合物（comp）=所有峰的总和（cas、mus和中性）。cas=Xa；mus=Xi。第3天ES复合*西斯特*CHART，第7天ES等位基因H3K27me3 ChIP（Simon等人，2013年）和小鼠胚胎成纤维细胞等位基因H3K4me3 ChIP（Yildirim等人，2012年）数据也包括在内进行比较。**（D）**qRT-PCR用于体外用FLAG-CTCF、FLAG-GFP和mock下拉RNA。所示四个生物复制的代表性结果。平均值±1 SD.*，第页<0.05，通过比较每个扩增子与Ppia的非配对双尾Student t检验确定。**（E）**UV-RIP qRT-PCR，比较αCTCF和IgG免疫沉淀第3天雌性mESC±UV交联。表示±1 SD。所示三个生物复制的代表性结果。*，显著富集(第页<0.05，由非配对双尾Student’s t检验确定）+UVαCTCF下拉比+UV IgG下拉；†，+UVαCTCF下拉比–UVαCTCFR下拉显著富集。

**图4。CTCF以非常高的亲和力特异性结合RNA**
另请参见图S5-S6。**（A）**RNA EMSA使用1.5 pmol纯化的重组FLAG-CTCF或FLAG-GFP和0.5 pmol各种体外-转录的末端标记的RNA探针。Comp，未标记竞争对手，40×摩尔过剩。*，CTCF-RNA换档。**（B）**RNA EMSA使用1.5 pmol的CTCF或GFP和0.5 pmol的Tsix RNA片段。的地图锡特/*Tsix公司*和EMSA探针如图所示。Comp，未标记竞争对手，40×摩尔过剩。*，CTCF-RNA换档。**（C）**带有0.5 pmol纯化Tsix探针d和1.5 pmol全长CTCF（FL）或GST-CTCF片段的RNA EMSA：N，N-末端结构域；锌、锌指结构域；C、 C-末端结构域；或仅GST。以40×摩尔过剩计算未标记竞争对手。**（D）**使用双滤膜结合分析绘制指定物种在0.2 nM RNA下CTCF的结合等温线。0-30 nM活性CTCF的连续2.5倍稀释。使用活性分数计算校正的CTCF浓度（图S5B）。绑定的硝化纤维膜。免费尼龙膜。**（E）**左侧面板：CTCF-RNA相互作用的结合等温线。右侧面板：K_d日和R²与RNA物种结合的CTCF值。“≫30 nM”表示K_d日高于可测量范围。**（F）**K（K）_d日数值与RNA大小无关(第页=0.7834).

**图5。CTCF更喜欢RNA而不是DNA**
另请参见图S5。**（A）**使用所示物种的0.2 nM探针的DNA EMSA，用活性CTCF蛋白的2倍系列稀释液滴定至300 nM.*，CTCF-DNA换档。**（B）**K（K）_d日和R²CTCF与各种DNA物种结合的值。“≫300 nM”表示K_d日高于可测量范围。**（C）**EMSA探针的竞争地图。如图所示，RNA探针对应于Tsix RNA的CLIP-seq片段。DNA探针来源于锡特和*Tsix公司*，如图所示。**（D）**使用0.2 nM Tsix RNA CLIP探针和5 nM纯化CTCF，在0、0.2、2.0、20和200 nM冷DNA竞争对手（comp）存在的情况下进行EMSA竞争。*，CTCF-六种RNA转移。“Tsix CLIP DNA”是指带有Tsix CLIP-seq片段序列的DNA探针，用作阴性对照。**（E、F）**使用0.2 nM ChIP1的互惠竞争EMSA（E）或ChIP2（F）DNA探针和200 nM纯化的CTCF，其中存在0、0.2、2.0、20和200 nM的冷RNA竞争物（comp）。*，CTCF-DNA换档。ChIP1和ChIP2 RNA是指带有ChIP1与ChIP2序列的RNA探针，用作阴性对照。

**图6。X-X配对需要Tsix和Xite RNA**
另请参见图S7。**（A）**Xic和配对中心的地图，以及RIP qPCR引物和EMSA探针的位置（箭头）。TsixKD位置（星号）：蓝色，shRNA；绿色，LNA；红色，LNA。这个*Tsix公司*主要启动子占Tsix转录本的90%。的位置*Tsix公司^TST公司*显示截断等位基因。锡特增强器表示eRNA。**（B）**以Tsix和Xite为阳性对照，U1 snRNA为阴性对照，对不同结构域的d3雌性mESC进行RIP qRT-PCR，±UV。qPCR位置如图A所示。两个生物复制品的平均值为±1 SD。所有数值均归一化为输入RNA的1%。第页，由未配对的双尾学生确定吨-在+UV样品中比较CTCF和IgG下拉的测试。**（C）**TsixKD对稳定表达shTsix和shScr的雌性克隆配对的影响。使用RP24（着丝粒）和pSx9双探针组合的DNA FISH(*西斯特/尖峰*)已执行。为了排除XO伪影，只对具有两个RP24信号的细胞核进行评分。显示了具有最近X-X距离的十分位数的累积频率曲线。整个分布如图S7所示。差异的重要性，第页，在不同分化日的ScrKD和TsixKD之间的成对比较中，使用未配对的双尾学生确定吨-测试。两个独立生物复制的代表性结果。样本量，n:ScrKD:261（d0），297（d2），295（d4），254（d6）；TsixKD:263（d0）、332（d2）、282（d4）、246（d6）。**（D、E）**定量*Tsix公司*ScrKD后的RNA与使用两个LNA的TsixKD。如图C所示进行配对分析。整体分布如图S7所示。2-3个独立生物复制的代表性结果。D类，样本量：ScrKD:295（d0），289（d3），294（d6）；TsixKD:277（d0）、303（d3）、310（d6）。E类，样本量：ScrKD:212（d0），186（d3），171（d6）；TsixKD，205（d0），202（d3），186（d6）。**（F）**shTsix KD mESC的EB生长受到严重影响。比例尺，100μm。**（G）**多能性标记物在雌性shTsix KD细胞中适当下调，表明细胞分化正常。表示±1 SD。**（H）** *西斯特*分化过程中shRNA TsixKD与ScrKD中的RNA FISH。第页，由χ决定²测试比较Xist的分布⁺来自d0、d2、d4和d6的ScrKD与TsixKD的细胞；[（观察到-预期）²/预期]，自由度=3。

**图7。Tsix和Xite RNA靶向CTCF顺式到配对中心**
**（A）**Xic和配对中心的地图，以及ChIP引物的位置。TsixKD位置，星号**（B）**稳定shTsix或shScr KD克隆的ChIP-qPCR。四个生物复制品的平均值为±1 SD。第页由非配对双尾确定吨-测试。**（C）**控制ChIP实验。上图：CTCF和X染色体其他位置的各种对照表位（OCT4、SMC3和H3K27me3）的ChIP-seq分析。底部面板：在X染色体指定位点的shScr和shTsix中的ChIP-qPCR显示，Tsix/Xite敲除对CTCF结合没有显著影响。三个独立生物复制的平均值为±1 S.D。**（D）**Tsix RNA的位点特异性作用有助于CTCF的局部特异性靶向。POL-II转录Tsix RNA，当RNA与CTCF结合时，该RNA仍与合成位点相连。Tsix RNA（t）的快速转换_1/2，30-60分钟），实现其特定于场地的动作。靶向CTCF反过来调节X-X配对。

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