Polyspecific pyrrolysyl-tRNA synthetases from directed evolution

doi:10.1073/pnas.1419737111

.2014年11月25日；111(47):16724-9.

doi:10.1073/pnas.1419737111。 Epub 2014年11月10日。

定向进化产生的多特异性吡咯烷酰-tRNA合成酶

附属公司

¹分子生物物理和生物化学系。
²分子生物物理、生物化学和化学系。
^三诺华生物医学研究院，马萨诸塞州剑桥02139；
⁴威斯康星大学麦迪逊分校化学系，威斯康星州麦迪逊，邮编53706；和。
⁵耶鲁大学分子生物物理、生物化学和化学系以及霍华德·休斯医学院，纽黑文，CT 06510；
⁶加拿大安大略省伦敦市西安大略大学生物化学系N6A 5C1patrick.odonoghue@uwo.ca dieter.soll@yale.edu。
⁷分子生物物理学、生物化学和化学系，以及patrick.odonoghue@uwo.ca dieter.soll@yale.edu。

PMID： 25385624
PMCID公司： PMC4250173
内政部： 10.1073/pnas.1419737111

定向进化的多特异性吡咯烷基tRNA合成酶

李涛郭等。美国国家科学院程序. 2014.

.2014年11月25日；111(47):16724-9.

doi:10.1073/pnas.1419737111。 Epub 2014年11月10日。

附属公司

¹分子生物物理和生物化学系。
²分子生物物理、生物化学和化学系。
^三诺华生物医学研究院，剑桥，马萨诸塞州02139；
⁴威斯康星大学麦迪逊分校化学系，威斯康星州麦迪逊，邮编53706；和。
⁵耶鲁大学分子生物物理、生物化学和化学系以及霍华德·休斯医学院，纽黑文，CT 06510；
⁶加拿大安大略省伦敦市西安大略大学生物化学系N6A 5C1patrick.odonoghue@uwo.ca dieter.soll@yale.edu。
⁷分子生物物理、生物化学和化学系patrick.odonoghue@uwo.ca dieter.soll@yale.edu。

PMID： 25385624
PMCID公司： PMC4250173
内政部： 10.1073/pnas.1419737111

摘要

吡咯烷酰-tRNA合成酶（PylRS）及其同源tRNA（Pyl）已成为遗传代码创新的理想翻译成分。酶的变体有助于将100多种非标准氨基酸（ncAAs）并入蛋白质中。之前选择PylRS变体将N（ε）-乙酰-Lys（AcK）酰化到tRNA（Pyl）上。在这里，我们检测了一种N（ε）-乙酰基-赖氨酸-tRNA合成酶（AcKRS），该酶具有多专一性（即对多种ncAAs具有活性），对苯丙氨酸衍生物的效率是对AcK的30倍。结构和生物化学数据揭示了AcKRS和PylRS变异体[碘代苯丙氨酸-tRNA合成酶（IFRS）]中多专一性的分子基础，该变异体在313个ncAAs的化学库中表现出增强的活性和底物杂化。国际财务报告准则是定向演进的产物，对不同的非竞争性会计准则具有不同的约束模式。这些数据表明，体内选择不会产生最佳特异性tRNA合成酶，并表明翻译保真度将成为遗传密码扩展到远超过20个氨基酸的主要因素。

关键词：氨酰-tRNA合成酶；遗传密码；遗传选择；翻译后修饰；合成生物学。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
(A类)研究中使用的nsAA的化学结构：1,我-吡咯烷（Pyl）；2，AcK；三,N个^ε-三氟乙酰基-我-赖氨酸（CF_三-AcK）；4，3-I-Phe；5，3-溴-我-Phe（3-Br-Phe）；6，3-氯-我-Phe（3-Cl-Phe）；7，3-三氟甲基-我-苯丙氨酸（3-CF_三-苯丙氨酸）；8，3-甲基-我-Phe（3-Me-Phe）；9，3-甲氧基-我-Phe（3-MeO-Phe）；10，3-溴-ThA。(B类)AcKRS3的底物特异性范围。ncAA-tRNA文库翻译sfGFP报告子（2位UAG密码子）^派尔用荧光强度测定。测试了94种不同Lys和Phe类似物的文库（数据集S1）。ncAA掺入产生的荧光信号2–5,7,9、和10标记在A中。A12为未添加ncAA的对照。A1井是检测WT-sfGFP（100%）生产信号的阳性对照实验。荧光数据和误差值（SD）由三个独立实验的条形图表示（也在数据集S1中给出）。颜色（紫色为0-4%，蓝色为4-8%，红色为18-24%，棕色为95-100%）用于指示UAG的读取级别。

**图2。**
PylRS和AcKRS3底物复合物的比较。(A类)PylRS活性位点视图[紫色，蛋白质数据库（PDB）ID代码2ZIM（38）]与Pyl-adenylate（Pyl-AMP；洋红）复合物。显示了与底物氨基酸的氢键（虚线），并指出了重原子之间的距离。(B类)AcKRS3（青色，PDB ID代码4Q6G）复合物与AcK和ATP类似物ADPNP的活性位点视图，突变残基显示为红色(C类)PylRS和AcKRS3结构重叠的活动现场视图。显示了PylRS的底物（Pyl-AMP）和关键识别残基（紫色，棒状）与AcKRS3活性部位的残基（青色或红色，棒状物）重叠。

**图3。**
WT-PylRS的结构比较(A类)和PylRS(B类–D类)与ncAA底物复合的变体。每个面板中都显示了PylRS变体和ncAA。父代PylRS的突变用粗体表示，突变的侧链用红色表示C类IFRS/3-I-Phe复合物显示了在晶体结构中观察到的两种3-I-Phe（洋红色，粉红色）的确认。灰色表面显示活性位点囊内的溶剂可及体积。这些体积是在没有ncAA底物的情况下计算的。包括Tyr384在内的循环在《国际财务报告准则》中的复杂结构中是无序的C类和D类和不可见。(电子)IFRS复合结构与3-I-Phe在两个确认书（品红色、粉红色）和3-Br-ThA（青色）中的结构叠加显示了ncAA底物的不同结合模式。

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