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.2014年9月24日；9（9）：e104666。
doi:10.1371/journal.pone.0104666。 2014年电子收集。

MicroRNA-377通过靶向VEGF调节缺血心脏间充质干细胞诱导的血管生成

直隶文 1, 魏黄 2, 冯玉良 2, 蔡文峰 2, 王玉华 2, 就到王晓红 三, 梁嘉良 2, 马什胡德·瓦尼 2, 陈静（音译） 4, Pin Zhu公司 5, 陈季梅 5, 罗纳德·米勒德 三, 郭昌凡 三, 王一刚 2
附属公司

MicroRNA-377通过靶向VEGF调节间充质干细胞诱导的缺血心脏血管生成

直隶文等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

微小RNA在各种细胞功能中得到了重视，包括对血管生成的调节。骨髓间充质干细胞（MSCs）移植到MI心脏通过旁分泌介导的血管生成改善心脏功能。然而，微RNA是否调节MSC诱导的血管生成尚待阐明。利用microRNA微阵列分析，我们在缺氧处理的MSCs中确定了microRNA表达谱，并观察到在所有失调的microRNA中，microRNA-377的表达量下降最为显著。我们还通过双核糖核酸酶报告分析和Western blotting验证了血管内皮生长因子（VEGF）是microRNA-377的靶点。内源性microRNA-377的敲除促进了人脐静脉内皮细胞中导管的形成。然后，我们用慢病毒载体将大鼠MSC转化为过度表达microRNA-377（MSC miR-377）或敲低microRNA377（MSC Anti-377）的MSC，以研究microRNA-377是否调节MSC诱导的心肌血管生成，并将感染慢病毒空载体的MSC作为对照（MSC Null）。将microRNA-engineered MSCs植入梗死大鼠心脏4周后，MSC Anti-377-h心脏的血管密度显著增加，与对照组相比，伴随着纤维化减轻和心肌功能改善。与MSC Null组相比，MSC miR-377治疗的心脏出现了不良反应，包括血管密度降低、心肌功能受损和纤维化增加。这些发现表明，低氧反应性microRNA-377直接靶向MSCs中的VEGF，内源性microRNA-377的敲除促进MSC诱导的梗死心肌血管生成。因此，微小RNA-377可以作为基于干细胞的缺血性心脏病治疗的新的治疗靶点。

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数字

图1
图1。在缺氧处理的间充质干细胞（MSCs）中测定miRNA表达谱。
(一个)：低氧处理大鼠MSCs miRNA微阵列中所有失调miRNA的热图。所有miRNA阵列原始数据可在在线补充表中获得（n=5个独立实验）。(B类)：微阵列数据通过火山图进行汇总，显示折叠变化和t检验标准（对数概率）。与正常氧处理的MSC相比，低氧处理的大鼠MSC中的MiR-377和MiR-210是最显著的失调MiR（绿色表示下调，红色表示上调）。(C类)：通过qPCR验证miR-377表达水平的变化（归一化为对照U6，n=5，p<0.05）。
图2
图2。抑制miR-377诱导的在体外毛细结构的形成。
(一个)：对U6进行归一化后的qPCR分析验证了内源性miR-377（Anti-377）的敲除和miR-376（miR-378）在转染miR-375抑制剂或模拟物的HUVEC中的过度表达。(B类):体外试管形成实验表明，miR-377的敲除增强了毛细血管样结构的形成，但这种作用受到miR-376过度表达的限制。比例尺=500µm。(C类)：毛细管总长度和支管点通过分析软件Image-Pro Plus 6.0（IPP）测量。所有数值均表示为平均值±SE；n=每组6个独立实验*P（P）<0.05.
图3
图3。双荧光素酶报告分析证实miR-377直接靶向VEGF。
(一个)：计算miRNA靶点预测分析巧合地显示，miRNA-377的片段5′-GAUCAC-3′与位于VEGF 3′UTR 1568-1574 nt的片段5′-GUGAUUC-3′配对良好，这是大多数哺乳动物（如大鼠、人类、黑猩猩、恒河猴、丛林婴儿、树鼩、小鼠）中的高度保守位点（红色字体）。(B类)：携带VEGF3′UTR的双荧光素酶报告载体（pEZX-MT01）示意图。(C类)：双核糖核酸酶报告分析结果的定量数据。所有数值均表示为平均值±SE；每组n=6*P（P）<0.05被认为具有统计学意义。
图4
图4。miR-377直接下调MSCs中VRGF的表达。
(一个)：针对β-肌动蛋白标准化后的qPCR分析显示，miR-377模拟物（miR-377）下调MSC中的VEGF mRNA，而miR-377抑制剂（Anti-377）上调MSC中的VEGF mRNA。根据miR-377模拟物和miR-377inhibitor作为阴性对照（NC），用打乱序列转染MSCsmiR公司和NC反对的分别）。(B类)Western blot分析显示miR-377模拟物（miR-376）和miR-377-抑制剂（Anti-377）诱导MSCs中VEGF蛋白水平的变化及其定量数据。所有数值均表示为平均值±SE；每组n=8*P（P）<0.05被认为具有统计学意义。(C类)：对β-肌动蛋白正常化后的qPCR分析显示，与正常氧处理的MSC相比，低氧处理的骨髓间充质干细胞中VEGF的表达显著上调，并且在MSC中进一步增加抗-377与NC组和miR-377组相比。所有数值均表示为平均值±SE；每组n=8*P（P）<0.05被认为具有统计学意义。
图5
图5。miR-377基因敲除引起的促血管生成作用在很大程度上依赖于VEGF。
体外试管形成试验表明，毛细管总长度(一个)和管支点(B类)通过转染miR-377-敲低的HUVEC中的VEGF siRNA显著降低。所有数值均表示为平均值±SE；每组n=6；* P（P）<0.05被认为具有统计学意义。
图6
图6。用慢病毒载体构建大鼠MSCs以过度表达或敲除miR-377。
(一个)：重组慢病毒载体示意图。Lenti-GFP，慢病毒空载体；慢病毒miR-377，慢病毒miR-377过表达载体；Lenti-Anti-miR-377，慢病毒miR-377抑制剂表达载体。(B类)：近100%的MSCs转染Lenti-GFP（MSC无效的)，Lenti-miR-377（MSCmiR-377)或Lenti-Off-miR-377（MSC抗-377)GFP荧光显示慢病毒感染72小时后。MSC间无形态学改变无效的、MSCmiR-377和MSC抗-377.比例尺=200µm。(C类)对U6进行归一化后的qPCR分析表明，MSC中miR-377的敲除抗-377以及miR-377在MSC中的过度表达miR-377型. (D类)：β-肌动蛋白归一化后的qPCR分析。(电子)：Western-blot一致显示MSC中VEGF的表达降低miR-377型而MSC增加抗-377，与MSC相比无效的所有数值均表示为平均值±SE；每组n=6；* P（P）<0.05与。移动交换中心无效的；# P（P）<0.05与。移动交换中心miR-377型.
图7
图7。内源性miR-377的敲除增强MSC介导的体内心肌血管生成。
(一个)：注射miR-工程MSCs 4周后从MI大鼠采集的心脏样本切片，用肌钙蛋白I（cTnT）抗体（Ab）（心肌细胞，红色）、α-平滑肌肌动蛋白（SMA）抗体（血管细胞，绿色；白色箭头）和DAPI（细胞核，蓝色）进行三重染色。在（A）MSC中测量血管密度无效的组(B类)MSC公司miR-377型组，和(C类)MSC公司抗-377组。毛细血管密度通过Von Willebrand（vWF）染色（绿色；白色箭头）确定(D类)MSC公司无效的组(电子)MSC公司miR-377型组和(F类)MSC公司抗-377组。IPP软件用于定量分析(G公司)不同治疗组的血管密度和毛细血管密度。所有数值均表示为平均值±SE；每组n=6。* P（P）<0.05与。惯性矩；# P（P）<0.05与。MI+MSC无效的.
图8
图8。向大鼠梗死心脏注射miR-377-敲低MSCs可限制纤维化并改善心脏功能。
(一个)：注射miR-工程MSCs 4周后从MI大鼠采集的心脏切片的5µm切片用Masson-Thichome染色。(B类)：使用Image J软件确定各种治疗中左心室（LV）纤维化的百分比。所有数值均表示为平均值±SE；每组n=6*P（P）<0.05被认为具有统计学意义。(C类)：MSC中的左室舒张末期直径（LVDd，黄色箭头）和左室收缩末期直径（LVDs，黄色箭头无效的组，MSCmiR-377型集团和MSC抗-377组采用超声心动图M型记录进行测量。所有超声心动图测量值均来自至少3个单独的心脏周期。(D类)：对各组LVDd、LVDs、LV射血分数（EF）和缩短分数（FS）的定量数据进行分析和比较。所有数值均表示为平均值±SE；每组n=6。* P（P）<0.05与。惯性矩；# P（P）<0.05与。MI+MSC无效的.
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