HIV-1 protease-induced apoptosis

doi:10.1186/1742-4690-11-37

.2014年5月20日11时37分。

doi:10.1186/1742-4690-11-37。

HIV-1蛋白酶诱导的细胞凋亡

迈克拉·伦洛娃¹, 伊万娜·基日·奥娃, 阿莱娜·凯普洛娃, 罗曼娜·哈德拉沃娃, 米查尔·多利泽尔, 卡罗琳娜·斯特罗哈莫娃, 伊瓦·皮乔娃, 米罗斯拉夫·哈耶克, 托马斯·拉姆

附属公司

PMID： 24886575
PMCID公司： PMC4229777
内政部： 10.1186/1742-4690-11-37

HIV-1蛋白酶诱导的细胞凋亡

迈克拉·伦洛娃等。逆转录病毒学. 2014.

.2014年5月20日11时37分。

doi:10.1186/1742-4690-11-37。

作者

附属

¹捷克共和国科学院有机化学和生物化学研究所，v，v，i，IOCB&Gilead研究中心，Flemingovo nám，2166 10 Prague，Czech Republic。rumlova@uochb.cas.cz。

PMID： 24886575
PMCID公司：项目经理4229777
内政部： 10.1186/1742-4690-11-37

摘要

背景：细胞凋亡是HIV感染和发展为艾滋病时CD4+T细胞耗竭的可能原因之一。然而，HIV-1在这一过程中的确切作用仍然无法解释。HIV-1蛋白酶（PR）被认为是一种可能的因子，但HIV-1 PR酶活性与细胞凋亡之间的直接联系尚未建立。

结果：在这里，我们表明活性HIV-1 PR的表达通过线粒体凋亡途径诱导HeLa和HEK-293细胞死亡。这一结论基于HIV-1 PR在线粒体中直接定位的体内观察，线粒体是触发细胞凋亡的关键因素。此外，我们观察到HIV-1 PR浓度依赖性降低线粒体膜电位，以及HIV-1公关在半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9激活、PARP裂解和DNA断裂中的作用。此外，体外数据表明，HIV-1 PR介导线粒体蛋白Tom22、VDAC和ANT的裂解，导致AIF和Hsp60蛋白的释放。通过酵母双杂交筛选，我们还鉴定了一个新的HIV-1 PR相互作用伙伴，乳腺癌相关蛋白3（BCA3）。我们发现BCA3加速bax启动子上的p53转录活性，从而提高促凋亡bax蛋白的细胞水平。

结论：总之，我们的结果描述了HIV-1 PR参与凋亡，这是由HIV-1公关对线粒体膜完整性的直接影响或与细胞蛋白BCA3的相互作用引起的。

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数字

图1
**M-PMV PR、HIV-1 PR和BCA3的相互作用。（a）**转染HEK-293细胞总裂解物的Western blot分析*c-myc-M-PMV PR17（D26N）*,*c-myc-M-PMV PR12（D26N）*,*c-myc-HIV-1 PR（D25N）*和*HA-BCA3型*用抗c-myc（上面板）和HA（下面板）抗体进行印迹。**（b）**用转染BCA3:HEK-293（1-4道）和HeLa（5-8道）细胞的M-PMV或HIV PRs共免疫沉淀*c-myc-M-PMV PR17（D26N）*,*c-myc-M-PMVPR12（D26N）*或*c-myc-HIV-1 PR（D25N）*与一起*HA-BCA3型*转染后48h裂解，用抗c-myc抗体免疫沉淀蛋白。用抗c-myc（上面板）或抗HA（下面板）抗体对沉淀进行印迹和显影。**（c）**共焦显微镜下HIV-1 PR（D25N）与BCA3在HEK-293细胞中的免疫共定位*c-myc-HIV-1 PR（D25N）*与一起*HA-BCA3型*转染后48小时用抗HA-TRITC或c-myc-FITC抗体染色，并用共焦显微镜观察。两块黑色面板代表不产生BCA3（第一排）和HIV-1 PR（第二排）的细胞样本，从而证明HA-TRITC和c-myc-FITC抗体不提供非特异性信号。

图2
**HIV-1 PR和BCA3的线粒体定位。（a）**HeLa细胞与*c-myc-HIV-1 PR（D25N）*，或*HA-BCA3型*和线粒体标记*pDsRed2-Mito公司*HeLa细胞转染后48小时用抗HA-TRITC或c-myc-FITC抗体染色，并用共焦显微镜观察。线粒体呈红色；重叠图像显示线粒体标记与BCA3和HIV-1 PR（D25N）以及HIV-1 RR（D25 N）与BCA3.共定位。**（b）**转染HeLa细胞的纯化线粒体*c-myc-HIV-1 PR（D25N）*,*HA-BCA3型*，或以下各项的组合*c-myc-HIV-1 PR（D25N）与HA-BCA3*使用线粒体标记抗体、抗HA和抗c-myc抗体的Western blot分析Optiprep梯度组分（标记为1–12）。**（c）**HEK-293细胞中VDAC（左图，条形表示500nm）、BCA3（中图，条形表示500nm）和HIV-1 PR（D25N）（右图，条形表示1μm）定位的免疫金TEM分析。**（d，e）**蛋白质印迹**（d）**免疫共沉淀后进行Western blot分析**（e）**细胞溶质和线粒体部分存在HIV-1 PR（D25N）和BCA3。HEK-293细胞（4x10⁵细胞/ml）与*HA-BCA3型*和*c-myc-HIV-1 PR（D25N）*48h后，用PBS冲洗细胞1×，将1/20的细胞重新悬浮在PLB中，作为总细胞裂解液样本用于Western blot分析(d日，车道1）。1/4的细胞用于免疫沉淀(**e（电子）**，通道4）使用抗HA和抗c-myc抗体。最后3/4的细胞用于分离细胞溶质和线粒体部分。使用Western blot分析100μl等分的细胞溶质和线粒体组分(d日细胞溶质和线粒体组分样品的900μl等分样品分别使用抗HA和抗c-myc抗体进行免疫沉淀，并通过Western blot进行开发(**e（电子）**，车道5和6）。

图3
**HIV-1 PR和BCA3的OMM定位。**共转染HEK-293细胞的纯化线粒体*c-myc-HIV-1 PR（D25N）*和*HA-BCA3型*用0.14μM培养**（a）**，1.4微米**（b）**或14μM（c）蛋白酶K在存在或不存在Triton X-100的情况下在冰上持续10分钟和60分钟。通过添加6×蛋白负载缓冲液（PLB）停止反应，并通过Western blotting分析样品。

图4
**HIV-1 PR的凋亡作用（a）**HIV-1 PR对HeLa细胞的细胞毒性作用。HeLa细胞被转染*c-myc-HIV-1感染*（1μg/ml），编码催化活性HIV-1 PR和不同转染后时间点的死亡细胞数，采用BD-LSR Fortessa流式细胞术进行PI染色。**（b）**HeLa细胞转染了指定数量的*c-myc-HIV-1感染*转染后6小时，用FITC Alexa Fluor®488膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）标记细胞，并用BD LSR Fortessa检测凋亡+死亡细胞。**（c）**对照和HIV-1 PR表达细胞的代表性门控。**（d）**HEK-293细胞转染不同数量的*c-myc-HIV-1感染*.ΔΨ的变化_米转染后6小时用JC-1荧光染色，然后用BD-LSR Fortessa流式细胞术测定。**（e）**控制和HIV-1 PR表达细胞的代表性门控。在FL 2通道中检测到含有红色JC-1聚集体的健康细胞，而在FL1通道（FITC）中监测到凋亡细胞中的绿色JC-1单体。**（f）**HEK-293细胞转染*c-myc-HIV-1感染*转染后24小时，使用Suicide-Track分离片段DNA^TM（TM）DNA梯形分离试剂盒，琼脂糖凝胶分离。显示了三个独立实验汇集的数据的平均百分比（±标准偏差）。每个数据点重复至少两次。

图5
**活性HIV PR对细胞蛋白质的蛋白质水解处理（a）**HEK-293细胞转染*HIV-1间隙*和*HA-BCA3型*（每个500 ng）和各种数量的*c-myc-HIV-1感染*（25–1000 ng）在转染后48小时进行分析。**（b-e）**HEK-293细胞转染*HIV-1 Gag病毒*和*HA-BCA3型*如材料和方法中所述，在转染后48 h进行裂解，并与重组HIV-1 PR（1.25μM）孵育，可选择在利托那韦（4μM）存在下孵育**（d）**或钙蛋白酶抑制剂I（100μM）**（e）**在37°C的温度下持续指定的时间。然后在12-15%SDS-PAGE上分离蛋白质，并用Western blot进行分析。**（f）**HIV-1 PR的放射自显影分析*在体外*通过TNT转录/翻译系统获得的全长p21Bax和N末端截断的p18Bax蛋白的裂解。蛋白质样品在室温下用HIV-1 PR（1.25μM）处理，并任选地在利托那韦（8μM）的存在下处理指定的时间。然后在15%SDS-PAGE上分离蛋白质，并通过放射自显影术进行可视化。**（g）**体外HIV-1 PR对线粒体蛋白的裂解。将从HEK-293细胞中新分离的线粒体与各种数量的重组HIV-1PR孵育，可选择在利托那韦（4μM）存在下孵育。样品中的蛋白质在12-15%的SDS-PAGE上分离，并进行Western blot分析。**（h）**从纯化的线粒体部分切割蛋白质后的上清液。来自的样本**（g）**离心，用Western blot分析上清液。

图6
**BCA3调节p53转录活性。**分析*bax（巴克斯）*-启动子荧光素酶报告子激活对剂量的响应*HA-BCA3型***（a）**,*HA-BCA3型*具有*c-myc-HIV-1 PR（D25N）***（b）**瞬时转染HEK-293细胞。**（c）**HEK-293细胞提取物中p53和Bax的内源性水平随着*HA-BCA3型*.（d）表达越来越多BCA3的HEK-293细胞中内源性p53的亚细胞分离和检测。**（e）**细胞溶质（C）、线粒体（M）和核（N）组分纯度的蛋白质控制：按照材料和方法中的描述纯化组分，并使用抗细胞色素C（线粒体标记）和层粘连蛋白A（核标记）抗体进行分析。**（f）**表达HIV-1 PR、BCA3或两者的凋亡、Anexin-V阳性细胞的平均百分比。每个实验一式三份；给出了三个独立实验的平均值（带标准偏差）。HIV-1 PR和BCA3之间的p值不显著（p<0.4700295），分别由第1列和第2列表示。HIV-1 PR+BCA3表达对细胞凋亡的影响具有统计学意义，表达HIV-1 RR和BCA3的细胞分别表现为p<0.0047547和p<0.0015748。

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1. Arnoult D、Viollet L、Petit F、Lelievre JD、Estaquier J.HIV-1引发线粒体死亡。线粒体。2004;4:255–269. doi:10.1016/j.mito.2004.06.010。-内政部-公共医学
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[9] Ferri KF、Jacotot E、Blanco J、Este JA、Kroemer G.线粒体对HIV-1编码蛋白诱导的细胞死亡的控制。Ann N Y科学院。2000;926:149–164.-公共医学

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