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.2014年5月20日；111(20):7319-24.
doi:10.1073/pnas.1324151111。 Epub 2014年4月28日。

增强子RNA参与雄激素受体驱动的选择性增强基因激活的环

陈林谢 1, 滕飞 2, 陈一文 三, 李天天 1, 高燕飞 4, 王晓东 1, 孙彤（Tong Sun） 1, 克里斯托弗·J·斯威尼 1, Gwo-Shu玛丽·李 1, 陈绍勇 4, 史蒂文·鲍尔克 4, 小乐刘雪莉 三, 迈尔斯·布朗 2, 菲利普·坎托夫 5
附属公司

增强子RNA参与雄激素受体驱动的选择性增强基因激活的环

谢振林等。 美国国家科学院程序. .

摘要

雄激素受体（AR）是调节前列腺癌细胞行为和命运的关键因素。当AR结合增强子元件并调节特定增强子-启动子环时，AR调节网络被激活。激肽释放酶相关肽酶3（KLK3）编码前列腺特异性抗原（PSA），是一个众所周知的AR调节基因，其上游增强子产生双向增强子RNA（eRNAs），称为KLK3e。在这里，我们证明KLK3e促进了KLK3增强子和KLK2启动子的空间相互作用，并增强了KLK1长距离转录激活。KLK3e携带来源于雄激素反应元件III（ARE III）的核心增强子元件，这是AR和介体1（Med1）相互作用所必需的。此外，我们发现KLK3e依赖于核心增强子元件的完整性来处理RNA依赖的增强子活性。在人前列腺组织中，KLK3e的转录是可检测的，其表达与KLK3（R（2）=0.6213，P<5×10（-11））和KLK2（R（2=0.5893，P<五×10（-10））显著相关。有趣的是，KLK3e的RNAi沉默对前列腺癌细胞增殖产生适度的负面影响。因此，我们报道雄激素诱导的eRNA支架化AR相关蛋白复合物，该复合物调节染色体结构并选择性增强AR依赖基因的表达。

关键词：KLK3e/AR/Med1复合物；染色体成环。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
KLK3增强子产生lncRNA。(A类)KLK3附近的染色质状态。AR、H3K27ac和H3K4me1的ChIP-seq数据集（19）。(B类)RT-qPCR分析DHT（10 nM）处理后LNCaP细胞中反义KLK3 eRNA（红条）、义KLK13 eRNA-（绿条）和成熟KLK3-（蓝条）表达的时间依赖性。(C类,上部)与KLK3转录起始位点（TSS）相关的功能ARE位置图改编自参考文献。(下部)用10 nM DHT处理LNCaP细胞，RT-qPCR分析KLK3e片段的表达。LNA探针针对反义和正义KLK3e的区域如图所示。如图所示，qPCR的引物集被设计成专门针对KLK3e的反义（引物AS1–AS4）或义链（引物S1–S7）。右侧电泳图像显示反义（2230bp）和正义（2170bp）KLK3e的PCR产物。RT-qPCR分析的所有数据均归一化为载体（−）中的表达水平。数据显示为平均值±SD(n个≥3）。
图2。
图2。
KLK3e对KLK基因座的调节功能。(A类)LNCaP细胞中DHT暴露4和16小时后KLK转录物的热图（21）。基因在着丝粒激肽释放酶基因座中按顺序排列(顶部)到端粒(底部). (B类,上部)示意图显示了AR调节的KLK基因和KLK3e在19号染色体上的相对位置。(下部)用载体（−）或DHT（10 nM）和50 nM非沉默对照（siCtrl）或KLK3e siRNA（siKLK3 e）处理LNCaP细胞；小写“e”表示为eRNA。通过RT-qPCR评估KLK3e缺失对KLK基因的疗效和影响。(C类,上部)示意图显示了KLK3/2基因座。(下部)用载体或DHT处理LNCaP细胞4 h。通过RT-qPCR评估KLK2 mRNA的表达(插入). 通过qPCR测定锚定区（ARE III）和远端片段（阴影条）之间的相对交联频率，并将其归一化为对照区（片段A）。(D类)通过qPCR确定锚定区D和E区域之间的相对交联频率，并将其归一化为A区域。通过RT-qPCR或qPCR分析的所有数据均归一化为载体中的表达水平，并显示为平均值±SD(n个≥3），以及*P（P）< 0.05.
图3。
图3。
KLK3e/AR/Med1核糖核蛋白复合物转录调节靶启动子。在KLK3e-或Med1-缺失的LNCaP细胞中进行AR或Med1或活化Pol II（S5p）的染色质免疫沉淀（ChIP），在含有或不含有DHT（10 nM）的情况下进行2或8小时(A–C)qPCR用于测量AR、Pol II（S5p）和Med1在KLK2启动子上的作用。数据显示为平均值±SD(n个≥3）和*P（P）< 0.05.
图4。
图4。
核心增强子元件呈现KLK3e RNA依赖增强子活性。(A类,上部)示意图显示KLK2启动子驱动荧光素酶报告子的插入。(下部)在插入或不插入KLK3e全长（S1–S7）、翻转（S7–S1）和ARE删除（S2-S7）的情况下进行报告者分析。(B类)如图所示，报告者分析用独立过度表达载体共同转染报告者。(C类)siKLK3e的作用(左侧)或siMed1(赖特)KLK2启动子驱动的荧光素酶活性。在DHT（10 nM）存在下测量荧光素酶活性24小时。所有数据均为至少三个独立实验的平均值±SD*P（P）< 0.05; 萤火虫荧光素酶/雷尼利亚荧光素酶（FL/RL）。
图5。
图5。
KLK3e选择性增强AR调节的基因表达。(A类)LNCaP细胞用载体或DHT（10 nM）和/或siCtrl或siKLK3e处理。通过RT-qPCR检测siKLK3e对AR调节基因表达的影响。(B类)KLK3e（S1）与体内靶基因表达的相关性。通过阈值周期差异（∆）对GAPDH的所有数据进行标准化C类T型)来自正常人前列腺(n个=4），初级(n个=11）和转移性(n个=32）前列腺肿瘤（25）。(C类)LNCaP细胞在5%木炭/右旋糖酐处理的FBS（C-FBS）培养基中培养，然后用乙醇（veh）或DHT（10nM）处理干扰对照（siCtrl）或KLK3e（siKLK3Ge）的siRNA敲除。用WST1法测定细胞生长。数据表示平均值±SD(n个≥3），以及*P（P）< 0.05. (D类)DHT诱导的eRNA/AR/Med1复合物功能活动的一种模型顺式（实线）和电位反式（碟线）基因激活事件。
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