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.2014年4月；32(4):381-386.
doi:10.1038/nbt.2859。 Epub 2014年3月23日。

单细胞的伪时间顺序揭示了细胞命运决定的动力学和调节器

科尔·特拉内尔 # 1 2, 戴维德·卡奇亚雷利 # 1 2 三, 乔纳·格里姆斯比 2, 普拉蒂·博克雷尔 2, 李树强 4, 摩斯 1 2, 尼尔·J·列侬 2, 肯尼斯·利瓦克 4, Tarjei S Mikkelsen公司 1 2 三, 约翰·莱恩 1 2
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单细胞的假时间排序揭示了细胞命运决定的动力学和调节因子

科尔·特拉内尔等人。 Nat生物技术. 2014年4月.

摘要

由于单个细胞之间基因表达的高度可变性，定义诸如细胞分化等时间过程的转录动力学具有挑战性。体细胞的时间序列基因表达分析很难区分转录级联的早期和晚期，也很难识别罕见的细胞亚群，而单细胞蛋白质组学方法依赖于关键区别标记的先验知识。这里我们描述了Monocle，这是一种无监督算法，它使用多个时间点收集的单细胞RNA-Seq数据来提高转录组动力学的时间分辨率。将Monocle应用于人类原代成肌细胞的分化，发现关键调节因子的表达、基因调节的序列波以及未知在分化中起作用的调节器的表达发生了开关样变化。我们在功能丧失屏幕中验证了一些预测的调节器。原则上，单核可以用于从广泛的细胞过程中恢复单细胞基因表达动力学，包括分化、增殖和致癌转化。

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图1
图1
分化成肌细胞的单细胞RNA-Seq。A） 原代人成肌细胞在高血清培养基中培养。在切换到低血清培养基后，细胞被分离并以24小时为间隔单独捕获。为每个细胞制备RNA-Seq文库并测序。B） 与大量RNA-Seq（n=3，生物复制）相比，在时间零点采集的单个细胞的平均基因表达水平。C） 成肌细胞分化晚期标志物（烯醇化酶3，ENO3公司; 肌球蛋白重链3，3令吉)在单个细胞中。D） 在对所示标记物进行细胞取样时进行代表性免疫荧光染色（肌细胞增强因子2C，绿色为MEF2C；肌球蛋白重链，红色为MYH2/MHC；蓝色为Hoechst染色）。
图2
图2
单核细胞通过分化过程对单个细胞进行排序。A） Monocle算法概述。B） 二维独立组件空间中的细胞表达轮廓（点）。连接点的线表示由Monocle构建的MST的边缘。实心黑线表示MST的主要直径路径，并提供单细胞“假时间”排序的主干。C） 由Monocle（行）识别的差异表达基因的表达水平，细胞（列）以伪时间顺序显示。不包括成纤维细胞。D） 条形图显示采集时通过免疫荧光测定的MEF2C和MYH2表达细胞比例（上面板）、采集时的RNA-Seq（中面板）或伪时间的RNA-Seq（下面板）。MEF2C被认为在100FPKM或以上可检测地表达，MYH2在1FPKM可检测地表达。MEF2C在细胞中呈现双峰表达模式（未显示），100 FPKM的阈值将模式分开。E） 肌肉分化关键调控因子的表达水平，按时间顺序收集。（细胞周期素依赖性激酶1，CDK1型; DNA结合抑制剂1，标识1; 肌生成素（Myogenin，MYOG）F）来自面板D的调节器，由Monocle在假时间内订购。
图3
图3
细胞的假时间排序揭示了基因在分化早期被激活或抑制，以及潜在的上游调控因子。（左）相对基因表达水平为K-均值聚类。每个簇的平均表达以红色显示，每个簇中已知在肌发生中起作用的示例基因以蓝色突出显示。（中）与每个簇中的基因相关的选定基因本体术语。（右）每个簇中基因调控元件中具有保守结合位点基序的转录因子数量。转录因子根据其结合的调节元件的功能进行分离。右侧显示了示例，已知的肌源性因子用黑色表示，而在肌肉分化中没有已知作用的因子用红色表示。
图4
图4
选定转录因子的功能丧失屏幕。A） shRNA病毒感染指示基因后，在分化培养基中培养4天后，表达MYH2的细胞内细胞核分数（上面板）、MYH2的全周面积（中面板）和细胞核计数（下面板），归一化为模拟shRNA对照。对于每个mRNA，测试了四个独立的shRNA，并报告了对MYH2+细胞细胞核分数影响最大的两个结果。报告的数值是每种感染的4个技术复制的平均值，双尾Studentt吨-测试并由Benjamini Hochberg修正。误差条表示平均值的2个标准偏差。星号表示在FDR<5%时，模拟控制的显著差异。B） ENCODE鉴定的增强子（绿色）和启动子（紫色）中保守转录因子结合位点基序的共现分数。分数按对数计算10-经过Bonferroni多重试验修正后，超几何试验的转换p值（见方法）。C） 抑制剂可能通过两种机制之一阻止成肌细胞过早分化。
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