The absence of core fucose up-regulates GnT-III and Wnt target genes: a possible mechanism for an adaptive response in terms of glycan function

doi:10.1074/jbc.M113.502542

。2014年4月25日；289(17):11704-11714.

doi:10.1074/jbc。M113.502542。 Epub 2014年3月10日。

核心岩藻糖上调GnT-III和Wnt靶基因的缺失：聚糖功能适应性反应的可能机制

附属公司

¹RIKEN-Max Planck联合研究中心疾病糖组，RIKEN，2-1 Hirosawa，Wako，Saitama 351-0198。
²RIKEN全球研究集群结构糖生物学团队，RIKEN-Max Planck联合研究中心，RIKEN，2-1 Hirosawa，Wako，Saitama 351-0198。
^三大阪市Izumi妇幼保健医学中心研究所，日本大阪594-1101，Izumi-Murodo-cho，840。
⁴RIKEN-Max Planck联合研究中心疾病糖组，RIKEN，2-1 Hirosawa，Wako，Saitama 351-0198。电子地址：tani52@wd5.so-net.ne.jp。

PMID： 24619415
预防性维修识别码：项目经理4002080
内政部： 10.1074/jbc。M113.502542

核心岩藻糖的缺失上调GnT III和Wnt靶基因：聚糖功能适应性反应的可能机制

池本雅子等。生物化学杂志。 2014。

。2014年4月25日；289(17):11704-11714.

doi:10.1074/jbc。M113.502542。 Epub 2014年3月10日。

附属公司

¹RIKEN-Max Planck联合研究中心疾病糖组，RIKEN，2-1 Hirosawa，Wako，Saitama 351-0198。
²RIKEN全球研究集群结构糖生物学团队，RIKEN-Max Planck联合研究中心，RIKEN，2-1 Hirosawa，Wako，Saitama 351-0198。
^三大阪市Izumi妇幼保健医学中心研究所，日本大阪594-1101，Izumi-Murodo-cho，840。
⁴疾病糖原团队，理研-马克斯·普朗克联合研究中心，理研，2-1 Hirosawa，Wako，Saitama 351-0198。电子地址：tani52@wd5.so-net.ne.jp。

PMID： 24619415
预防性维修识别码：项目经理4002080
内政部： 10.1074/jbc。M113.502542

摘要

在正常和病理条件下，聚糖在多种蛋白质功能中起着关键作用，但由于聚糖功能的冗余或补偿，一些糖基转移酶缺乏的小鼠没有或仅表现出轻微的表型。然而，我们对这些观察的潜在机制只有有限的了解。我们之前的研究表明，70%缺乏核心岩藻糖结构的Fut8-deficient（Fut8（-/-））小鼠在出生后3天内死亡，但其余小鼠存活长达数周，尽管它们表现出生长迟缓和肺气肿。在本研究中，我们表明，在Fut8（-/-）小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中，另一个N-聚糖分支结构，二分GlcNAc，通过增强负责酶N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III（GnT-III）的基因表达而特异性上调。作为二分GlcNAc修饰的候选靶糖蛋白，我们证实Fut8（-/-）MEF中β1-整合素和N-钙粘蛋白上的二分Glc NAc水平增加。此外，利用质谱法对Fut8（-/-）小鼠血清中IgG1的聚糖分析表明，体内缺乏Fut8也会增加二等分GlcNAc的含量。作为一种潜在机制，我们发现在Fut8（-/-）MEFs中Wnt/β-catenin信号上调，并且发现一种抑制Wnt信号的抑制剂可以消除GnT-III的表达，表明Wnt/？-catenin参与GnT-II上调。此外，Fut8（-/-）MEF中的各种氧化应激相关基因也增加。这些数据表明，Fut8（-/-）小鼠通过诱导包括GnT III在内的各种基因来适应体内外的氧化应激，这可能会补偿核心岩藻糖功能的丧失。

关键词：β-连环素；二分GlcNAc；核心岩藻糖；富特8；糖基转移酶；GnT-III；凝集素；质谱（MS）；氧化应激；Wnt Pathway。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**二分GlcNAc水平在*未来8*^−/−MEF公司。** A类，的符号表示N个-显示了聚糖和负责的糖基转移酶，如GnT-III、GnT-IV、GnT-V和Fut8。凝集素，如L4-PHA、E4-PHA和AAL，优先识别指示位点。B类制备的细胞裂解物（40μg蛋白质）的凝集素印迹分析*未来8*^+/+和*未来8*^−/−采用AAL、E4-PHA和L4-PHA进行MEF。以抗β肌动蛋白为内标进行Western blot分析。

**图2。**
**GnT-III的活性和表达水平在*未来8*^−/−MEF公司。** A类中的、Fut8、GnT-III、GnT-IVa、b和GnT-V酶活性*未来8*^+/+和*未来8*^−/−MEF裂解物显示为平均值±S.E(n个= 3)B类，*未来8*^+/+和*未来8*^−/−在10厘米的培养皿上生长的MEF在100%融合的情况下收获。通过实时PCR定量这些MEF中GnT-III、-IVa、-V和核糖体mRNA的表达水平。GnT-III、-IVa和-V的表达水平通过相应的核糖体RNA表达水平进行标准化。数据表示为平均比率±S.E(n个=3）。C类、Fut8、GnT-III和核糖体mRNA的表达水平*未来8*^+/+，*未来8*^−/−并重新引入MEF(重新)通过实时PCR定量。Fut8和GnT-III的表达水平通过相应的核糖体RNA表达水平进行标准化。数据表示为平均比率±S.E(n个= 3).

**图3。**
**总体N个-MALDI-TOF MS的聚糖结构分析。** A类，MALDI-TOF质谱N个-连接的聚糖来自*未来8*^+/+和*未来8*^−/−MEF公司。糖类命名和低聚糖的表示符合功能性糖组学联合会提出的指南。所有观察到的离子对应于[M+Na]⁺。B类将单个聚糖的信号强度标准化为所有检测到的聚糖（高甘露糖、bi-、tri-和四天线复合型聚糖）的总强度，以此计算聚糖流行率，并将其描述为总轮廓的百分比。C类，MS²和MS^三二甲基化的光谱N个-聚糖来自*富特8*^+/+(*面板i*和*ii（ii）*)和*未来8*^−/−MEF公司(*面板iii*和*iv（四）*)分别是。碎片离子位于*米/z*444.0 (*第二组*)和*米/z*426.5 (*第四组*)表明前体离子具有二分GlcNAc。

**图4。**
**在IgG中观察到含有GlcNAc的聚糖呈双链₁仅从*未来8*^−/−小鼠血清。** A类、IgG的MALDI-TOF质谱₁-衍生糖肽*未来8*^+/+(*上部面板*)和*未来8*^−/−(*下部面板*)如图所示。所有这些已鉴定的离子均来自含Asn-297的IgG₁1156.5 Da肽（EEQFNSTFR）。B类，糖肽谱来自血清IgG₁属于*未来8*^+/+和*未来8*^−/−老鼠。数据表示平均值±S.E(n个= 3).C类，英寸*未来8*^−/−小鼠血清中9.7%的聚糖为二分聚糖。

**图5。**
**凝集素分析显示，β1-整合素和N-钙粘蛋白的糖基化在*富特8*^+/+和*未来8*^−/−MEF公司。** A类，免疫沉淀(*IP（IP）*)β1-整合素来自*未来8*^+/+和*未来8*^−/−MEF裂解产物由抗β1整合素抗体和AAL、E4-PHA和L4-PHA凝集素检测。*工作分解结构*，蛋白质印迹。B类MEF裂解物，无论是否经唾液酸酶处理，均用抗β1整合素抗体进行Western印迹。β1-整合素的聚糖结构不同于唾液酸化*未来8*^+/+和*未来8*^−/−MEF公司。C类，凝集素印迹（AAL和E4-PHA）和来自*未来8*^+/+，*未来8*^−/−，并重新引入(重新)进行了MEF。β1-整合素的上带(箭头)对应于成熟形式，与AAL和E4-PHA识别。D类，膜组分中的免疫沉淀N-钙粘蛋白*未来8*^+/+和*未来8*^−/−用抗N-钙粘蛋白抗体和E4-PHA和L4-PHA凝集素检测MEF。

**图6。**
**抑制Wnt信号诱导β-catenin和GnT-III mRNA水平下调*未来8*^−/−MEF公司。** A类，Wnt信号抑制剂（15μ米IWP-2）显著降低β-catenin和GnT-III的mRNA水平。相反，当MEF与15μ米IWP-2英寸*未来8*^+/+和*未来8*^−/−数据表示平均值±S.E(n个= 3).B类，磷酸化β-catenin在*未来8*^−/−MEF公司。*第S33/S37/T41页*，磷酸化-Ser-33/Ser-37/Thr-41；*pS552型*，磷-Ser-552；*第675页*，磷-Ser-675。*IP（IP）*，免疫沉淀。C类Wnt信号抑制剂可减少β-catenin在胞浆和细胞核中的积累。D类β-catenin与N-cadherin共免疫沉淀*未来8*^+/+和*未来8*^−/−MEF公司。

**图7。**
**Wnt信号转导级联的示意图*富特8*^+/+和*未来8*^−/−MEF公司。**Wnt由内质网分泌(*急诊室*)通过添加膜结合酶的棕榈酰化，*和O-*酰基转移酶被指定为豪猪（Wnt-on）。当分泌的Wnt与Frizzled受体结合时，β-catenin磷酸化被抑制，β-catanin在胞浆中积累，然后增加向细胞核的募集。这可能导致GnT-III的表达增加。IWP-2是Wnt信号的抑制剂*未来8*^+/+MEF、β-连环蛋白向细胞外间隙的分泌受到抑制，磷酸化和泛素化得到适当处理。细胞内β-catenin浓度降低，其核募集也减少。这导致GnT-III基因表达受到抑制。

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1. Orr S.L.、Le D.、Long J.M.、Sobieszczuk P.、Ma B.、Tian H.、Fang X.、Paulson J.C.、Marth J.D.、Varki N.（2013）对36种糖基转移酶或聚糖结合蛋白基因靶向缺陷突变小鼠菌株的表型调查。糖生物学23，363–380-项目管理咨询公司-公共医学
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