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.2014年4月；42（8）：e68。
doi:10.1093/nar/gku156。 Epub 2014年2月20日。

fourSig：一种确定4C-Seq数据中染色体相互作用的方法

小雷克斯·L·威廉姆斯 1, 约书亚·斯塔默, 约书亚·W·穆福德, J毛罗·卡拉布雷斯, 彼得·米茨科夫斯基（Piotr Mieczkowski）, Della Yee公司, 特里·马格努森
附属公司

fourSig：一种确定4C-Seq数据中染色体相互作用的方法

小雷克斯·L·威廉姆斯等。 核酸研究. 2014年4月.

摘要

染色体构象和基因表达的关联能力提供了大量有关细胞正确调节基因活性的策略的信息。4C-Seq是一种相对较新且越来越流行的技术，可以确定基因组中单个点产生的基因组相互作用集。4C-Seq实验产生了大量复杂的数据集，必须正确区分信号和噪声。目前，分析4C-Seq数据的方法数量有限。在这里，我们提出了一种新的方法，fourSig，它除了精确和简单易用之外，还包括一个新功能，该功能对检测到的交互进行优先级排序。我们的结果证明了fourSig与先前发布的和新的4C-Seq数据集的有效性，并表明我们的显著性优先级与重复之间的重复检测交互作用的能力相关。

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数字

图1。
图1。
确定重要交互作用的方法。(A类)捕获片段的序列被映射到基因组，并且映射到每个3C片段的读取次数被用作观察到的分布。(B类)（步骤1）所需数量3C碎片的滑动窗口，W公司，并确定每个窗口中观察到的数据的总读取数。（步骤2）染色体上的读取在3C片段中随机分布，并计算每个窗口的新读取数。（步骤3）切断，X（X），使用每个窗口的随机读取数据为所需的FDR计算。（步骤4）X（X）从至少1000次随机洗牌中计算，以生成所需FDR的可能截止值的直方图。（步骤5）在观测数据集中调用显著丰富窗口的最终阈值设置为计算的第95个百分位X（X）s.在所描述的示例中，小于0.01的期望FDR导致每个窗口40次读取的最终阈值，以调用4C数据中的重要交互。(C类)使用基于平均随机排列分布的FDR截止值（左）和根据应用于FDR计算分布的置信限确定的截止值（右）独立计算了十个显著性阈值。y轴表示每个窗口的读取数的显著性阈值。两种计算均表示FDR<0.01。
图2。
图2。
按分布形状确定交互的优先级。(A类)构造捕获事件的模型如图（左）所示，并带有符号图例（右）。频繁发生的交互预计会产生映射到本地可用片段的读取分布，并以接触概率最高的点（中心）为中心。(B类)通过重新评估窗口容量，使其超过最丰富片段（虚线）的读取计数转换的显著性阈值，为峰值分配与预期分布相对应的优先级。如果在对最丰富的片段中的读取次数进行折扣时，窗口仍很重要，则将窗口归类为宽窗口（类别1）；如果在用相邻片段的平均读取次数替换最丰富的碎片时，可以超过阈值，则将窗口归类为中等窗口（类别2）；如果可以超出阈值，则归类为窄窗口（类别3）如果只有在包含所有数据时才能超过显著性阈值。
图3。
图3。
等位基因表达偏倚的验证Ibtk公司. (A类)在两种不同的TS细胞系中，从RNA-Seq实验中检测到的等位基因特异性阅读的比例显示出对CAST等位基因的严重表达偏向Ibtk公司标记细胞系以反映菌株的亲代遗传模式（母系×父系）。(B类)的表达偏差Ibtk公司经等位基因特异性qRT-PCR证实。每个细胞系分析两次，一式三次。结果显示为相对于Gapdh公司.
图4。
图4。
与Ibtk公司TSS公司。(A类和B类)在相互作用中发现的3C片段在重复的4C-Seq实验中具有相似的重叠比例。在B6（A）和CAST（B）等位基因重复序列的交叉中发现了数量相似的相互作用片段。(C类)不同交互片段集的峰值优先级分类。复制交互片段的优先级类别显示为总交集的比例（顶部）。对于B6和CAST等位基因，对每个复制中指定分类的相互作用比例进行平均，这些等位基因用于复制交叉点（中间）中发现的片段和复制特有的片段（底部）。
图5。
图5。
已复制顺式-交互作用Ibtk公司TSS公司。A沿着9号染色体绘制了复制的广泛相互作用片段的检测到的读数分布（黑色=B6，红色=CAST）（上面板）。围绕Ibtk公司轨迹（蓝色方框）展开（下面板）。(B类)宽交叉口顺式-B6和CAST等位基因之间的整个染色体的相互作用。(C类)按距离对所有独特和常见交互集的比例分解Ibtk公司TSS公司。
图6。
图6。
通过FISH验证选定的交互作用。(A类和B类)显示了常见交互（a）和B6特定交互（B）的典型FISH图像。活性等位基因（箭头）是通过RNA信号（红色）与Ibtk公司TSS（绿色）。距离是从Ibtk公司信号和来自相互作用探针的信号（白色）。细胞核被4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（蓝色）复染。(C–E类)根据探测轨迹和Ibtk公司TSS由DNA-FISH测量。测量的位点代表4C确定的B6等位基因（C，n个=56），特定于CAST等位基因（D，n个=51）或两个等位基因共有的（E，n个= 51). 的表达式状态Ibtk公司通过RNA信号与Ibtk公司TSS公司。活性等位基因的测量用红色追踪，而抑制的等位基因用黑色追踪。所有距离均以微米为单位。使用精确的二项检验确定趋势的显著性。
图7。
图7。
假定增强子的等位基因特异性相互作用Ibtk公司UCSC基因组浏览器4C相互作用数据和选定染色质数据的屏幕截图Ibtk公司轨迹如图所示。第24和25外显子Ibtk公司用箭头高亮显示。包含Ibtk公司TSS由棕色虚线矩形表示。与先前报道的调控元件对齐的假定基因内增强子由实心黑色矩形包围。对于染色质免疫沉淀测序轨迹，绿色框表示双等位基因富集，蓝色框表示CAST特异性富集，灰色框表示SNP检测不足，无法进行等位基因特异性调用。
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