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.2014年1月30日；505(7485):706-9.
doi:10.1038/nature12946。

人类转录组RNA二级结构的景观和变异

越湾 1, 昆曲 2, 羌峰崖张 三, 瑞安·A·弗林 三, Ohad庄园 4, 郑庆欧阳 5, 张嘉靖 三, 罗伯特·C·斯皮塔尔 三, 迈克尔·P·斯奈德 6, 埃兰·西格尔 4, 霍华德·Y·张 三
附属公司

人类转录组RNA二级结构的景观和变异

越湾等。 自然. .

摘要

与蛋白质合成的遗传密码平行，第二层信息以RNA结构的形式嵌入到所有RNA转录物中。RNA结构几乎影响基因表达程序的每一步。然而，大多数RNA结构的性质或序列变异对结构的影响尚不清楚。在这里，我们报告了人类家庭三人组（母亲、父亲和他们的孩子）RNA二级结构（RSS）的初始景观和变化。这提供了人类编码和非编码RNA的综合RSS图。我们识别出区分开放阅读框架和拼接连接的独特RSS特征，并定义真正的microRNA-binding位点。从细胞中分离出的天然脱蛋白RNA与重新折叠的纯化RNA的比较表明，大多数RSS信息是在RNA序列中编码的。1900多个转录的单核苷酸变体（约占所有转录单核苷酸变体的15%）改变了局部RNA结构。我们发现了决定点突变影响RSS能力的简单序列和间隔规则。在精确的位置对“核糖体密码子”和结构上同义变体的选择性缺失表明，在数千个位点选择特定的RNA形状，包括3'非翻译区、微RNA的结合位点和全基因组范围的RNA结合蛋白。这些结果突出了RNA结构及其变异对基因调控的潜在广泛贡献。

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数字

图1
图1。PARS揭示了人类RNA结构的景观
一，实验概述。b条，饼图显示了每个碱基至少有一个读取覆盖的结构导向RNA的分布。c（c）高（红色箭头）和低（绿色箭头）PARS得分映射到snoRNA74A的二级结构。d日5’UTR、编码区和3’UTR的PARS得分（顶部：重命名转录物；中部：天然脱蛋白转录物）和GC含量（底部），所有转录物的平均值，由翻译起始和终止位点对齐。（对于5'UTR、CDS和3'UTR，平均区域分别以粉红色、蓝色和绿色阴影显示）。
图2
图2。转录后调控的RSS特征
一、转录物外显子连接处的平均PARS评分和GC含量。b条，AGO-bounded（红色）与non-AGO-bonded（灰色）位点的miRNA位点的平均PARS得分（Top）和PARS得分差异（Bottom）。结构不同的区域为米色和浅灰色。c（c），AGO-iCLIP结合单链与双链miRNA靶位点。d日,P（P）-差分AGO-iCLIP绑定的值(t吨-测试，第页=0.05（灰色）。e（电子），观察到与预期AGO绑定(第页-值，X平方检验）。（f）miRNA过表达后，具有可访问和不可访问miR142（左）或miR148（右）位点的mRNA的表达变化（Wilcoxon秩和检验）。
图3
图3。PARS识别RiboSNitches全基因组
一，PARS得分（左）和PARS得分差异（右）MRPS21型父亲和母亲等位基因。b、 c（c），的Seqfold模型MRPS21型A和C等位基因（单链和双链碱基分别以绿色和红色圈出）。d日，三重奏中识别为RiboSNitches的SNV数量。e、 （f），RiboSNitches的平均PARS得分变化(e（电子）)最初位于双绞线（红色）或单绞线区域（蓝色）；或(（f）)经历从A/T到G/C（红色、粉红色）或从G/C到A/T（深蓝和浅蓝色）的核苷酸变化。0表示SNV在X轴上的位置。
图4
图4。转录组中功能性RSS元件的遗传证据
一，RSS选择测试示意图：不改变重要RNA结构形状的突变可以耐受并积累(左边)但改变RNA形状的RiboSNitch将在进化上被选中并移除。b–d段，RiboSNiches与结构上同义SNV的选择性缺失b条，3’UTR；c（c）预测的miRNA靶位点；d日，特定RBP结合位点。P（P）-该值是通过chi-square检验计算得出的。e（电子），RiboSNitches冲击拼接。PSI得分被计算为交替剪接的同种型与总同种型的比率（方法，第页=0.0006，学生的t吨-测试）。
扩展数据图1
扩展数据图1。PARS数据准确映射到已知结构
一在结构探测中，将核糖核酸酶V1和S1核酸酶滴定至单击动力学。在1μg总人类RNA存在下，使用不同稀释度的核糖核酶V1（通道4、5）和S1核苷酸酶（通道6、7）进行酵母RNA结构探测的凝胶分析，在37°C下裂解15分钟。此外，还显示了RNase T1阶梯（通道2）、碱性水解（通道1）和无核酸酶处理（通道3）。V1核酸酶按1:500稀释，S1核酸酶按照1:50稀释，得到的RNA大多是完整的。b条，使用双链酶RNase V1（红线）或单链酶S1核酸酶（绿线）为四膜虫核酶P9-9.2结构域获得的PARS信号与传统足迹法（蓝线）获得的信号精确匹配。c（c），PARS评分的前10个百分点（双链，红色箭头）和PARS评分的后10个百分点（单链，绿色箭头）被映射到四膜虫核酶的二级结构。
扩展数据图2
扩展数据图2。PARS数据在生物复制之间是可重复的
一细胞株GM12878、GM12891和GM12892之间的mRNA丰度散点图表明，细胞之间的基因表达高度相关（R>0.9）。b条，在细胞GM12878与GM12891、GM12878对GM12892、GM12891对GM12891和GM12891与GM12892之间的转录本中，20个核苷酸窗口中PARS评分皮尔逊相关性的累积频率分布，覆盖率至少为10个读/基。黑色虚线表示正相关窗口的比例。c（c），在20个核苷酸窗口中，GM12878重折叠转录物与GM12878天然脱蛋白复制体1转录物、GM12878重新折叠转录物和GM12878自然脱蛋白复制品2转录物之间，PARS评分的皮尔逊相关性的累积频率分布，覆盖率至少为10读/基，以及天然脱蛋白复制1转录物与天然脱蛋白的复制2转录物。
扩展数据图3
扩展数据图3。PARS可用于天然脱蛋白RNA
一，天然脱蛋白转录物PARS示意图。b条、使用RNA结构缓冲液（通道3）中的RNase V1对酵母RNA进行结构探测的凝胶分析，在含有1%NP40、0.1%SDS和0.25%脱氧胆酸钠的裂解缓冲液中使用RNase V2（通道5和6），在RNA结构缓冲区（通道4）中使用S1核酸酶，在裂解缓冲区（路径7和8）中使用S2核酸酶。此外，显示了RNase T1梯形（泳道2）和碱性水解（泳道1）。酶在裂解缓冲液和结构缓冲液中的裂解类似。c（c），天然脱蛋白snoRNA74A的结构探测。将PARS得分的前10%（高，红色箭头）和后10%（低，绿色箭头）映射到snoRNA74A的二级结构模型。d日，对天然脱蛋白转录物上PARS读数的深度测序和绘图为数千个转录物提供了结构信息，包括编码和非编码RNA。e（电子），我们比较了20个核苷酸窗口的Pearson相关性，其中覆盖率至少为100个读取（覆盖率>=5），转录物被重折叠和天然脱蛋白。y轴表示负相关窗口（R<0）在每个RNA类窗口总数中的比例。（f），外显子-外显子连接处的PARS评分，所有天然脱蛋白转录物的平均值（负荷>=1）。核苷酸C加G的百分比是整个转录本的平均值。
扩展数据图4
扩展数据图4。miRNA靶位点可及性增加5'影响AGO结合
一PAR-CLIP中AGO结合位点和非结合位点之间PARS评分显著不同的碱基。碱基0是与miRNA种子区直接碱基配对的mRNA的最多5'位置。Y轴表示的log10第页-值，通过Wilcoxon秩和检验计算。b条，使用iCLIP对碱基−3到1为单链（绿色）或双链（红色）的预测miRNA靶位点的平均AGO结合读进行元基因分析。c、 d日，计算每个目标扫描预测站点的基础−3到1的平均PARS得分。当miRNA 142过度表达时，绘制具有最易接近（100）和最不易接近（一百）位点的基因的基因表达变化图(c（c）)和miRNA 148(d日).P（P）-该值通过Wilcoxon秩和检验进行计算。
扩展数据图5
扩展数据图5。PARS在人类转录组中鉴定出RiboSNitches
一，对照组中掺杂的SNV（GM12891 vs.GM12892）与包括rRNAs、snRNAs和snoRNAs的结构化RNA之间PARS评分差异的累积频率图。带点的黑线表示一个阈值，超过该阈值，我们称SNV为RiboSNitch。X轴表示PARS评分在GM12891和GM12892之间的绝对变化。b条，杂合、纯合RiboSNitches和生物噪声周围PARS评分的绝对变化。红线表示个体间相同（噪声）序列之间PARS得分的变化。蓝线表示具有RiboSNitch的两个序列之间PARS评分的变化。紫色线表示纯合子RiboSNitches之间PARS评分的变化。c（c），包含或不包含SNV的转录物的实验结构破坏系数（eSDC）的累积频率图eSDC=（1-Pearson相关）*sqrt（转录长度）。d日，根据eSDC得分对成绩单进行排名，并将其分为结构破坏程度最高和最少的2000份成绩单。结构破坏程度最高的转录物更有可能含有SNV，而结构破坏程度最低的转录物则不太可能含有SNVs。e（电子），饼图，显示结构变化基础的分布(第页=0.05，FDR=0.1）。78.2%的这些碱基存在于具有SNV或indel的转录物中，表明核苷酸序列对RNA结构很重要。（f），三人组中每对个体之间通过PARS识别的RiboSNitches数量。灰色表示非结构性变化的SNV，红色表示RiboSNitiches。
扩展数据图6
扩展数据图6。PARS识别的MRPS21 5'UTR中RiboSNitch的足迹验证
一使用S1核酸酶（通道5（父亲）、通道6（母亲））和SHAPE探针（通道9（父亲）和通道10（母亲）对MRPS21 RNA的150个片段进行凝胶分析。此外，还显示了排序车道（车道1、2）、未切割车道（车道3（父亲）、车道4（母亲）和DMSO处理车道（车道7（父亲），车道8（母亲））。黑色箭头表示父亲和母亲等位基因之间的结构变化。b条，顶部：显示了包含RiboSNitch的转录本部分的序列。RiboSNitch为红色。底部：父亲和母亲等位基因S1测序的单链图谱。Y轴表示每个底座上的信号占区域中总信号的百分比。c、 d日，使用S1核酸酶手工结构探测MRPS21等位基因的SAFA定量(c（c）)和形状(d日).e（电子）S1测序读数与儿童的A或C等位基因唯一对应。灰色方框表示通过等位基因特异性映射显示儿童结构差异的碱基。（f），使用DMS足迹法对MRPS21 RNA的150个片段进行凝胶分析（通道1、2和3（父亲）、4、5和6（母亲））。黑色箭头表示父亲和母亲等位基因之间的结构变化。克，使用SAFA定量两个MRPS21等位基因的DMS足迹。
扩展数据图7
扩展数据图7。PARS鉴定的HLA-DRB1转录物中RiboSNitch的足迹验证
一，显示了包含RiboSNitch的部分转录本的序列。RiboSNitch为红色。使用S1核酸酶（泳道5（母亲）、6（父亲））和SHAPE探针（泳道9（母亲）、10（父亲））对HLA-DRB1 RNA A和G等位基因的2个片段进行凝胶分析。此外，还显示了排序车道（车道1、2）、未切割车道（车道3（母亲）、车道4（父亲））和DMSO处理车道（车道7（母亲），车道8，父亲）。黑色箭头表示父亲和母亲等位基因之间的结构变化。b条S1测序在RiboSNitch上读取父亲和母亲的信息。c、 d日，使用S1核酸酶对两个等位基因的RNA足迹进行SAFA量化(c（c）)和形状(d日).e（电子），使用DMS对HLA-DRB1 RNA A和G等位基因的2个片段进行凝胶分析（通道1、3和4（母亲）、2、5和6（父亲））。黑色箭头表示父亲和母亲等位基因之间的结构变化。（f），使用SAFA定量两个HLA-DRB1等位基因的DMS足迹。g、 h时，G alelle的二级结构模型(克)和A等位基因(小时)HLA-DRB1，使用PARS数据引导的Seqfold。核糖飞虱的2个等位基因分别以橙色和蓝色显示。红色和绿色圆圈分别表示PARS得分>=1和<=-1的基数。
扩展数据图8
扩展数据图8。PARS鉴定的WSB1转录物中RiboSNitch的足迹验证
一，显示了包含RiboSNitch的WSB1转录物部分的序列。RiboSNitch为红色。使用RNase V1（通道5（母亲）、6（父亲））、S1核酸酶（通道7（母亲），8（父亲）和SHAPE探针（通道9（母亲）和10（父亲）对WSB1 RNA T和C等位基因的2个片段进行凝胶分析。此外，还显示了排序车道（车道1、2）、DMSO未切割车道（车道3（母亲）、车道4（父亲））。黑色箭头表示父亲和母亲等位基因之间的结构变化。b条，父亲和母亲在整个RiboSNitch区域中S1测序读数的分数超过了总S1测测序读数。c、 d日，使用S1核酸酶对两个等位基因的RNA足迹进行SAFA量化(c（c）)和形状(d日).
扩展数据图9
扩展数据图9。RiboSNitches的额外足迹验证
一，Top:父系和母系等位基因片段的凝胶分析HLA-DQA1、hnRNP-AB、HLA-DRA、LDHA、XRCC5、FNBP1、和YWHAB公司使用SHAPE（通道4（父亲），通道6（母亲））。此外，还显示了DMSO控件（通道3（父）、5（母））和梯形图通道（通道1（T梯形图）、2（G梯形图））。黑线表示SNV的位置。凝胶侧面的黄色条表示父亲和母亲等位基因之间发生变化的区域。底部：父亲（GM12891）和母亲（GM12892）之间PARS信号的差异，集中在RiboSNitch。阳性PARS评分表示双链RNA，应与较低的SHAPE信号相对应。PARS评分为阴性表示未配对RNA具有相应较高的SHAPE信号。7个克隆RNA中有6个在体外通过SHAPE验证。hnRNP-AB公司显示了SNV周围的多重差异；SHAPE数据证实了RiboSNitch，并表明结构重排比PARS显示的更复杂YWHAB公司没有显示预测的RSS差异。b条，条形图显示了通过等位基因特异性映射在儿童中验证（红色）和未验证（灰色）的父母纯合子SNV的数量。父亲和母亲之间的纯合子RibiSNitches被映射到重生的子RNA（在试管婴儿中）和天然脱蛋白子RNA（天然脱蛋白儿童）。由于天然脱蛋白样品的覆盖深度较低，我们检测到的亲本中纯合子不同的SNV较少。
扩展数据图10
扩展数据图10。核桃仁的特性
a、 b条，最初居住在越来越单链的SNV周围的平均PARS得分差异(一)或越来越多的双绞线(b条)区域。c（c），SNV两侧均为双链碱基、双单链碱基或每侧各有一个单链和一个双链碱基周围的平均PARS得分差异。d日，以RiboSNitches为中心的其他SNV密度与2450个非结构改变SNV的对照组相比。P（P）-Kolmogorov-Smirnov试验计算的值。e（电子）根据两个等位基因之间的最大结构差异计算出前10%结构破坏性最强的RiboSNitches的分布，而对照组为1855个SNV，这些SNV在5'UTR、CDS和3'UTR中没有改变结构。（f），将993个独特核糖体单核苷酸序列的不同基因组特征或注释与1009个对照单核苷酸序列进行比较。对于每个基因组注释，通过Student t检验将位于注释覆盖的基因组区域的RiboSNitches的分数（例如组蛋白标记）与对照SNV的分数进行比较。截止值为第页=0.05（T检验）。
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