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.2014年3月；88(6):3474-84.
doi:10.1128/JVI.03286-13。 Epub 2014年1月8日。

线粒体易位蛋白TSPO通过内质网相关蛋白降解途径抑制HIV-1包膜糖蛋白的生物合成

陶周 1, 英当, 郑永辉
附属公司

线粒体易位蛋白TSPO通过内质网相关蛋白降解途径抑制HIV-1包膜糖蛋白的生物合成

陶周等。 J维罗尔. 2014年3月.

摘要

HIV-1 Env糖蛋白折叠在内质网（ER）中，这是病毒进入和复制所必需的。目前，尚不清楚这一过程是如何监管的。内质网中的糖蛋白折叠由内质网相关蛋白降解（ERAD）途径控制，该途径专门针对错误折叠的蛋白质进行降解。此前，我们报道HIV-1复制在人类CD4（+）T细胞系CEM中受到限制。挪威克朗（NKR）。为了了解这一机制，我们首先分析了NKR细胞中的细胞蛋白表达，发现线粒体转位蛋白TSPO的水平上调了约64倍。值得注意的是，当用TSPO拮抗剂PK-11195、Ro5-4864或地西泮处理NKR细胞时，HIV限制被完全破坏，短发夹RNA（shRNAs）敲除TSPO也达到了类似的效果。接下来我们分析了病毒蛋白的表达，有趣的是，我们发现Env的表达受到了特异性抑制。TSPO敲除和TSPO拮抗剂处理均可恢复NKR细胞中Env的表达。我们进一步发现，Env蛋白被迅速降解，ERAD途径抑制剂kifunensine可以恢复Env表达和病毒复制，这表明Env蛋白在NKR细胞中通过ERAD途径被错误折叠和降解。我们还使用CRISPR/Cas9（簇状、规则间隔、短回文重复序列[CRISPR]/CRISPR-associated-9）技术敲除了293T细胞中的TSPO基因，并发现TSPO可以类似地抑制这些细胞中Env的表达。综上所述，这些结果表明TSPO通过ERAD途径抑制Env蛋白的表达，并表明线粒体在调节Env折叠过程中起着重要作用。

重要性：HIV-1 Env糖蛋白是病毒感染所必需的，了解其在感染细胞中的表达途径将确定抗逆转录病毒治疗的新靶点。Env蛋白折叠在内质网中，通过经典分泌途径分泌。Env折叠过程涉及通过形成二硫键和在～30 Asn残基上进行重N-糖基化来广泛交联10 Cys残基。目前，尚不清楚这一过程是如何监管的。在这里，我们在HIV非许可人类CD4（+）T细胞系CEM中研究了这一机制。NKR。我们发现Env蛋白通过细胞途径快速降解，该细胞途径专门针对错误折叠的蛋白，导致Env表达受到抑制。重要的是，我们已经确定了一种线粒体易位蛋白，TSPO，它可以通过干扰Env折叠过程来触发这种降解。TSPO抗病毒活性的进一步表征将揭示以Env蛋白为靶点的新型抗逆转录病毒机制。

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数字

图1
图1
NKR细胞对凋亡诱导的抵抗。（A） 对细胞死亡的抵抗力。用1μM As处理指示细胞2O（运行）三，并通过将瑞舒林转化为瑞舒芬来检测细胞活力（见材料和方法）。未经处理的细胞（对照，Ctrl）的存活率被视为100%，而处理细胞的存活率则被计算并表示为相对值。（B） 抗凋亡。用1μM As处理指示细胞2O（运行）三用JC-1染色。然后使用FL1和FL2通道在流式细胞仪上测量细胞荧光。每个实验都至少重复两次，得到了一致的结果。
图2
图2
NKR细胞中TSPO高水平表达。（A） 线粒体蛋白表达的微阵列测定。CEM中的mRNA表达谱。用人类基因组U133 Plus 2.0阵列（Affymetrix）分析NKR（NKR）、CEM-SS（SS）和CEM-T4（T4）细胞。之后，共选择246个线粒体蛋白，并将其表达水平作为相对比率进行比较，如图所示。（B） CEM衍生细胞中TSPO蛋白的表达。所示的细胞裂解液由1×107细胞，六分之一的样本用所示抗体进行免疫印迹分析。（C） 为了比较TSPO在N2-NP和N5-P细胞中的表达水平之间的差异，来自N2-NP细胞的裂解物被连续稀释，然后通过蛋白质印迹与未稀释的N5-P细胞衍生样品的裂解物进行比较。每个实验都至少重复两次，得到了一致的结果。
图3
图3
TSPO配体对NKR细胞HIV-1限制的破坏。（A） PK11195和Ro5-4864对HIV-1限制性的影响。N2-NP细胞感染HIV-1（pNL4-3），并用增加量的PK11195或Ro5-4864处理。通过测量p24来确定病毒复制间隙在培养上清液中使用ELISA。（B） 其他TSPO配体对HIV-1限制的影响。在HIV-1感染期间，用50μM FGIN-1-27、65μM PK11195、50μM Ro5-4864或5μM地西泮处理N2-NP和N5-P细胞，并测定病毒复制。本实验中使用的这些化合物的浓度最高，不影响细胞活力（数据显示）。（C） 胆固醇对HIV-1限制的影响。用0.2μM As处理NKR、N2-NP、N5-P和SS细胞2O（运行）三、50μM胆固醇（Chol）或25μM水溶性胆固醇（β-CD-Chol），或在HIV-1感染期间未治疗，并检测病毒复制。每个实验都至少重复两次，得到了一致的结果。
图4
图4
（A） HIV-1在原始NKR、非许可亚克隆N2-NP、半许可亚克隆N8-SP和许可亚克隆N 5-P细胞中的复制。总计2×105用等量的HIV-1（pNL4-3）培养细胞，每隔一天用p24测定病毒复制间隙ELISA法。（B和C）As2O（运行）三和PK11195增加Env表达。用VSV-G假型HIV-1刺入指示细胞，并在存在或不存在0.25μM As的情况下培养2O（运行）三或50μM PK11195。通过超速离心从培养上清中纯化病毒。如图所示，通过Western blotting检测病毒粒子（B）和病毒产生细胞（C）中的病毒蛋白表达。每个实验都至少重复两次，得到了一致的结果。
图5
图5
TSPO击倒增加HIV-1复制。（A） 通过Western blotting比较TSPO敲除（KD）和对照细胞系中TSPO的表达。这些细胞系是通过稳定转导两种不同TSPO-specific shRNA或一种对照（Ctrl）shRNA创建的，如材料和方法所述。（B） 指示细胞感染野生型（WT）或ΔVpr HIV-1，并通过p24测定病毒复制间隙ELISA检测。（C） TSPO敲除细胞系和对照细胞系中Env表达水平的比较。指示细胞感染HIV-1，通过Western blotting检测Env和Gag的表达。
图6
图6
Env蛋白通过ERAD途径快速降解。（A） 快速环境退化检测。N5-P和N2-NP细胞被HIV-1（pNL4-3）感染24小时。细胞被脉冲标记为[35S] Met-Cys培养1小时，然后培养指定的时间长度。使用抗gp120抗体免疫沉淀Env蛋白，并通过放射自显影术进行分析，然后使用Image-Quant TL程序进行定量。（B） Kifunensine（KIF）在N2-NP细胞中拯救HIV-1复制。用增加的KIF处理感染HIV的N2-NP和N5-P细胞，并用p24测定病毒复制间隙ELISA法。（C） KIF拯救NKR和N2-NP细胞中的Env表达。用VSV-G假型HIV-1接种指示细胞，并在没有或存在40μM KIF的情况下培养48 h。细胞被裂解，并通过Western blotting测定Env和Gag的表达水平。（D） ERAD通路的激活抑制Env表达。在HIV-1感染期间或未经治疗期间，用布雷费尔丁A（10μg/ml）、衣霉素（5μg/ml。
图7
图7
TSPO抑制293T细胞中HIV-1 Env的表达。（A） 人体Cas9失活示意图TSPO公司轨迹。数字表示TSPO公司打开阅读框。19-bp引导RNA靶序列以绿色显示，原间隔区相邻基序（PAM）以红色显示。用于扩增该基因位点的正义引物TSPO-ko-S和反义引物TSPO-ko-A序列以下划线表示。（B） 通过Western blotting分析从转染Cas9和TSPO引导RNA表达载体的293T细胞中分离的三个克隆（A2、A3和A4）中TSPO蛋白的表达。（C） 从TSPO公司用TSPO-ko-S和TSPO-ko-A引物对A3克隆和野生型（WT）293T细胞进行定位，并用10%TBE-聚丙烯酰胺凝胶进行分析。M、 标记。（D） 用HIV-1前病毒克隆pNL4-3转染野生型和A3细胞，并通过蛋白质印迹分析Gag和Env蛋白表达水平。（E） 将指示数量的pNL4-3和TSPO表达载体转染到A3细胞中，并通过Western blotting分析TSPO和HIV-1病毒蛋白的表达水平。
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