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.2014年1月31日；289(5):2755-64.
doi:10.1074/jbc。M113.493650。 Epub 2013年12月12日。

脯氨酰羟化酶结构域蛋白（PHD）在罗格列酮诱导脂肪细胞分化中的作用

朱英·金 1, 玄贞光, 吉英查, Yun-Seung Jeong先生, 桑达尔·李, Hyae Gyeong Cheon公司
附属公司

脯氨酸羟化酶结构域蛋白（PHD）在罗格列酮诱导的脂肪细胞分化中的作用

朱英·金等。 生物化学杂志. .

摘要

罗格列酮是一种众所周知的胰岛素增敏剂，通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）刺激脂肪细胞分化。先前使用C3H10T1/2小鼠间充质多能干细胞进行的二维蛋白质组学研究表明，在罗格列酮诱导的脂肪细胞分化（RIAD）过程中，脯氨酰羟化酶域蛋白（PHD）水平显著升高。在本研究中，我们研究了PHD在RIAD中的功能作用。在RIAD期间，发现三种PHD亚型（PHD1、2和3）在C3H10T1/2细胞中上调，而PHD敲除和PHD抑制剂（二甲基草酰甘氨酸或乙基-3,4-二羟基苯甲酸酯）治疗可阻断RIAD。PHD抑制被发现与抗脂肪生成蛋白（如GATA-3、KLF-2）和带PDZ结合基序的转录辅激活子（TAZ）的水平增加有关，其泛素化减少，表明PHD引起抗脂肪生成蛋白质的泛素化/蛋白酶体降解。另一方面，MG-132（蛋白酶体抑制剂）阻止抗脂肪生成蛋白的降解并延缓RIAD。PPARγ拮抗剂（双酚A二缩水甘油醚或GW9662）减弱罗格列酮对PHD调节的影响。此外，通过ChIP-PCR在PHD启动子区发现了假定的PPARγ结合位点，这意味着罗格列酮可能通过PPARγ激活直接诱导PHD上调。与体外结果一致，对ob/ob小鼠口服罗格列酮2周可增加脂肪PHD水平，并通过增加其泛素化降低抗脂肪生成蛋白水平。这些结果表明，罗格列酮以PPARγ依赖的方式增加PHD的表达，这导致抗成脂蛋白参与泛素-蛋白酶体途径并随后诱导脂肪细胞分化。

关键词：脂肪细胞；脂肪细胞分化；脂肪生成；糖尿病；GATA-3；类KLüppel因子（KLF）；博士；PPARγ；过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）；罗西格列酮。

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数字

图1。
图1。
对照组、KR-62980治疗组和罗格列酮治疗组C3H10T1/2细胞表达蛋白模式的二维图像和对比分析。C3H10T1/2细胞在KR-62980或罗格列酮存在下分化。这些细胞的裂解液在二维凝胶上分离，然后银染以显示蛋白质斑点。A类，控制单元。B类，KR-62980处理的细胞。C类罗格列酮处理的细胞。
图2。
图2。
罗格列酮诱导PHD的时间依赖性。用罗格列酮（10μ米)在指定的时间。油红O染色法测定脂肪细胞分化程度(A类)，RT-PCR(B类)和Western blotting(C类). 实验进行了三次，并给出了具有代表性的结果。使用UN-SCAN-IT凝胶5.1版软件（Silk Scientific）进行密度分析。
图3。
图3。
罗格列酮诱导PHD的浓度依赖性。用指定浓度的罗格列酮处理C3H10T1/2细胞10天，通过油红O染色测定脂肪细胞分化程度(A类)，RT-PCR(B类)和Western blotting(C类). 实验进行了三次，并给出了具有代表性的结果。使用UN-SCAN-IT凝胶5.1版软件（Silk Scientific）进行密度分析。C类，控制；R（右）罗格列酮。
图4。
图4。
PPARγ参与罗格列酮诱导的PHD上调。用BADGE（20μ米)或GW9662（10μ米)在罗格列酮（10μ米)持续10天。油红O染色法测定脂肪细胞分化(A类)，并通过RT-PCR分析PHD1、2和3的mRNA水平(B类).C类用罗格列酮或载体处理的C3H10T1/2细胞进行ChIP-PCR，并通过半定量PCR和凝胶电泳进行评估。C类，控制；R（右）罗格列酮；B类、徽章；G公司GW9662；M（M），尺寸标记。对PPARγ和对照IgG的两个生物复制品进行了测试。使用UN-SCAN-IT凝胶5.1版软件（Silk Scientific）进行密度分析。
图5。
图5。
PHD抑制剂对罗格列酮诱导脂肪细胞分化的影响。用DMOG（1 m）处理C3H10T1/2细胞米)或EDHB（100μ米)有无罗格列酮（10μ米)连续培养10天（每48h换一次培养基）。油红O染色监测脂肪细胞分化程度(A类和C类)通过RT-PCR测定每个基因的mRNA水平(B类和D类). 实验进行了三次，并给出了具有代表性的结果。C类，控制；R（右）罗格列酮。
图6。
图6。
罗格列酮和PHD抑制剂对抗脂肪生成蛋白表达的影响。用指定浓度的罗格列酮处理C3H10T1/2细胞(A类)或使用DMOG(D类; 1米米)或EDHB(E类; 100 μ米) (B类)在罗格列酮（10μ米)持续10天。每48小时更换一次培养基，并通过蛋白质印迹分析细胞提取物中GATA-3、KLF-2和TAZ的表达。实验进行了三次，并给出了具有代表性的结果。C类，控制；R（右）罗格列酮。C类用罗格列酮（10μ米)连续10天，用每个PHD亚型免疫沉淀全细胞提取物，然后用GATA-3、KLF-2和TAZ抗体免疫印迹。实验进行了两次，并给出了具有代表性的结果。
图7。
图7。
罗格列酮对抗脂肪生成蛋白泛素化的影响。罗格列酮处理C3H10T1/2细胞(R（右）) (10 μ米)在有或无PHD抑制剂的情况下持续10天。免疫沉淀全细胞提取物(IP（IP）)使用抗多泛素抗体，然后使用抗GATA-3、抗KLF-2或抗TAZ进行免疫印迹(A类和B类). 作为对照，使用小鼠IgG抗体进行免疫沉淀(C类). 另外，通过Western blotting分析全细胞提取物中的这些抗脂肪生成蛋白。D类DMOG；E类EDHB；Ub（英国），泛素；C类，控制。MG-132（5μ米)在10天分化方案结束时加入分化培养基中，培养6或24小时，然后通过Western blotting分析全细胞提取物(C类). 实验进行了两次，并给出了具有代表性的结果。
图8。
图8。
PHD敲低对罗格列酮诱导的脂肪细胞分化的影响。通过转染异构体特异性shRNAs，PHD1、2和3亚型被敲除(第页)在10天分化期的第0天和第4天。通过RT-PCR确定击倒程度(A类)油红O染色监测脂肪细胞分化(B类).C类，控制；R（右）罗格列酮。C类在每个PHD表达下调后，免疫沉淀(IP（IP）)抗多泛素化的全细胞裂解物(Ub（英国）)抗体，然后进行免疫印迹(工作分解结构)使用抗GATA-3、抗KLF-2或抗TAZ。作为对照，使用小鼠IgG抗体进行免疫沉淀(C类). 实验进行了两次，并显示了具有代表性的结果。*，第页<0.05；**，第页< 0.01与控制。
图9。
图9。
体内罗格列酮对ob/ob小鼠的影响。罗西格列酮(R（右）)给ob/ob小鼠（9周龄，雄性）口服（10 mg/kg，每天一次），为期2周。血糖浓度(A类)和体重(B类)每周测定一次。给药2周后分离脂肪组织，通过Western blotting测定蛋白质表达(C类和D类)免疫沉淀法和免疫印迹法(E类).V（V），车辆；R（右）罗格列酮。实验进行了三次，并给出了具有代表性的结果。使用UN-SCAN-IT凝胶5.1版软件（Silk Scientific）进行密度分析。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01与车辆控制。
图9。
图9。
体内罗格列酮对ob/ob小鼠的影响。罗西格列酮(R（右）)给ob/ob小鼠（9周龄，雄性）口服（10 mg/kg，每天一次），为期2周。血糖浓度(A类)和体重(B类)每周测定一次。给药2周后分离脂肪组织，通过Western blotting测定蛋白质表达(C类和D类)以及用抗多泛素化抗体进行免疫沉淀，然后进行蛋白质印迹(E类).V（V），车辆；R（右）罗格列酮。实验进行了三次，并给出了具有代表性的结果。使用UN-SCAN-IT凝胶5.1版软件（Silk Scientific）进行密度分析。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01与车辆控制。
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