AAV1.NT-3 gene therapy for charcot-marie-tooth neuropathy

doi:10.1038/mt.2013.250

.2014年3月；22(3):511-521.

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AAV1.NT-3基因治疗炭疽性神经病变

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²俄亥俄州立大学/美国俄亥俄州哥伦布全国儿童医院神经病学系。
^三美国俄亥俄州哥伦布市俄亥俄州立大学/全国儿童医院儿科；美国俄亥俄州哥伦布市全国儿童医院研究所基因治疗中心。
⁴俄亥俄州立大学/美国俄亥俄州哥伦布全国儿童医院儿科；美国俄亥俄州哥伦布市全国儿童医院研究所基因治疗中心；俄亥俄州立大学/美国俄亥俄州哥伦布全国儿童医院神经病学系；美国俄亥俄州哥伦布俄亥俄州立大学/全国儿童医院病理科。

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AAV1.NT-3基因治疗炭疽性神经病变

扎里夫·萨亨克等。分子治疗. 2014年3月.

.2014年3月；22(3):511-521.

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²俄亥俄州立大学/美国俄亥俄州哥伦布全国儿童医院神经病学系。
^三俄亥俄州立大学/美国俄亥俄州哥伦布全国儿童医院儿科；美国俄亥俄州哥伦布市全国儿童医院研究所基因治疗中心。
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摘要

夏科特-马里奥（CMT）神经病变是一组异质性的周围神经疾病，影响2500人中的1人。一种变体CMT1A是原发性施旺细胞（SC）疾病，是最常见的单一变体。在之前的研究中，我们发现神经营养素-3（NT-3）可以改善颤抖（J）（Tr（J））小鼠，并且对CMT1A患者也有疗效。由于NT-3的半衰期短且缺乏有效性，因此不可能进行长期治疗。这导致人们考虑通过腺相关病毒（AAV）向肌肉输送NT-3基因治疗，作为这种神经营养因子广泛分布的分泌器官。在脱髓鞘CMT的Tr（J）模型中，rAAV1.NT-3治疗导致血液中可测量的NT-3分泌水平足以改善外周神经的运动功能、组织病理学和电生理学。此外，我们还表明，复合肌肉动作电位振幅可以作为功能改善的替代物，并确定了治疗剂量和优先肌肉特异性促进剂，以实现持续的NT-3水平。这些肌注rAAV1.NT-3的研究为将来的CMT1A临床试验提供了一个模板，有可能扩展到其他神经再生受损的神经疾病的治疗。

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数字

图1
**自互补scAAV1.tMCK。NFT3型**示意图显示了使用tMCK增强子/启动子、增强基因表达的内含子（I）、全长NTF3 cDNA和SV40 polyA尾部进行基因转移的盒。

图2
**使用捕获酶联免疫吸附试验（ELISA）从磷酸盐缓冲盐水（PBS）和AAV1.NT-3注射小鼠的血清NT-3水平**(一)scAAV1.CMV。1×10时的NT-3矢量¹¹在相同剂量下，vg产生的NT-3水平显著高于单链载体。在C57BL/6小鼠中进行不同时间间隔的剂量-反应研究，比较静脉注射scAAV1.tMCK后血清NT-3水平。NT-3和scAAV1.CMV。三剂NT-3（3×10⁹vg，1×10¹⁰vg和3×10¹⁰vg）。剂量减少一半（3×10¹⁰vg），CMV和tMCK载体产生的NT-3血清水平与从接受ssAAV1.CMV的小鼠获得的NT-3血浆水平相当。1×10时的NT-3¹¹vg剂量，产生生物反应。其他数据显示使用sc.AAV1.tMCK长期表达NT-3。3×10时的NT-3矢量¹⁰研究的最后一个数据点为长达6个月的vg。误差条代表标准误差(n个=每组3人）。(b条)Tr的NT-3水平（平均值±SEM）^J型小鼠在注射后24周。所有7组患者的NT-3水平均存在显著差异，*P（P）*值<0.0001。我们发现启动子和对照的最高和中等剂量载体的NT-3水平存在显著差异。然而，分析未能发现两种载体的低剂量存在显著差异。Kruskal–Wallis试验用于比较所有组的血清NT-3（PBS、CMV 3E+09/1E+10/3E+10和tMCK 3E+09/1E+10/3G+10）。曼·惠特尼U型-该测试用于比较各组和PBS（对照）组之间的NT-3，而Bonferroni校正用于调整多重比较。

图3
**Tr的功能改进**^J型 **小鼠腹腔注射ssAAV1.CMV。NT-3（1×10**¹¹**vg）与PBS对照组比较**(一)与PBS治疗的Tr相比，NT-3组新生坐骨神经的左后肢握力有显著改善^J型在病毒注射后18周，即15周的刷卡后时间点(n个=每组12人）。在一个没有神经挤压的平行组中，NT-3基因治疗组在10周左右开始在左后肢表现明显更好(b条)同时双侧后肢握力(**c（c）**)与PBS控制相比的强度测量(n个=每组14人）。(d日)注射后20至40周内收集的Rotarod性能显示，NT-3治疗组（AAV1.NT-3组，n个= 10; PBS组，n个= 9). 误差条表示标准误差。多个t吨-每行进行一次测试**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.001.

图4
**NT-3基因治疗改善颤抖神经病理**一微米厚的甲苯胺蓝染色塑料切片(一)晶体管^J型和(b条)野生型小鼠。Tr公司^J型小鼠神经髓鞘严重减退；箭头指向没有髓鞘的裸露轴突。(**c（c）**)来自Tr的坐骨神经^J型肌肉注射AAV1.NT-3 20周后，小鼠的轴突髓鞘较厚（箭头所示）。(d日)散点图显示克单个纤维与各自轴突直径的比值(n个=每组3人；>150轴突/小鼠）。AAV1.NT-3改善Tr的髓鞘减退状态^J型小鼠所有轴突直径，但主要是中小直径轴突。比例尺=5µm一,b条、和**c（c）**.

图5
**NT-3基因治疗提高再生和完整/未损伤颤抖神经的CS密度**棒材代表平均总SC密度±SEM(n个=每组4人）。与经磷酸盐缓冲盐水（PBS）处理的再生（Reg-PBS；*P（P）*<0.04）和完整处理的AAV1.NT-3（Int-NT-3；*P（P）*<0.001）副本。

图6
**NT-3基因治疗改善颤抖神经的神经丝细胞骨架**神经丝密度（数量/单位六边形面积0.05μm²)Tr在坐骨神经轴突中的分布^J型ssAAV1.CMV后20周的小鼠。NT-3（1×10¹¹与PBS治疗组相比，vg）注射显示向正常化方向向左移动。(一)包括野生型（WT）小鼠的直方图进行比较。(b条)野生型AAV1.NT-3和注射磷酸盐缓冲盐（PBS）对照Tr的神经丝细胞骨架的相同放大率代表性横截面积^J型显示坐骨神经。AAV1.NT-3基因治疗后神经丝密度降低。棒材=0.2μm。Western blot分析显示Tr外周神经的神经丝重（NF-H）亚单位磷酸化状态^J型ssAAV1.CMV后20周的小鼠。NT-3或PBS注射。(**c（c）**)AAV1.NT-3处理的Tr在根和坐骨神经中磷酸化NF-H的量增加^J型小鼠补充超微结构的发现。误差条代表标准误差（AAV1.NT-3组，n个=4；PBS组，n个= 5); **P（P）*<0.05。

图7
**NT-3基因治疗提高Tr复合肌肉动作电位（CMAP）**^J型老鼠.Tr上的坐骨神经CMAP^J型在基线、注射后20周和40周使用1×10¹¹ssAAV1.CMV的vg。显示NT-3或PBS。与基线相比，注射后20周，AAV1.NT-3组的CMAP振幅增加了28%，在40周时，PBS-Tr组的CMAP振幅增加了52%，具有统计学意义^J型对照组同期CMAP振幅下降。误差条代表标准误差(n个=基线检查时14周，每组20周；AAV1.NT-3组，n个= 10; PBS组，n个=40周时为9）**P（P）*<0.05。

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1. Marques W，Jr、Freitas MR、Nascimento OJ、Oliveira AB、Calia L、Melo A等。17p复制的夏科特-马利牙1A：新种群的特征。神经学杂志。2005;252:972–979.-公共医学
1. Houlden H，Reilly MM。常染色体显性脱髓鞘性木髓-髓牙病的分子遗传学。神经分子医学2006；8:43–62.-公共医学
1. Lupski JR、de Oca-Luna RM、Slaugenhaup S、Pentao L、Guzzetta V、Trask BJ等。与夏科特-马里奥-牙齿疾病1A型相关的DNA复制。单元格。1991;66:219–232.-公共医学
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