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.2013年8月7日；8（8）：e71553。
doi:10.1371/journal.pone.0071553。 2013年印刷。

Fas/Fas配体死亡受体通路参与苯丙氨酸诱导皮层神经元凋亡

黄晓东 1, 陆朝晖, 吕中伟, 于婷婷, 杨培荣, 沈永年, 于丁, 大福, 张晓平, 齐华福, 余永国
附属公司

Fas/Fas配体死亡受体通路参与苯丙氨酸诱导皮层神经元凋亡

黄晓东等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

苯丙酮尿症（PKU）是一种由苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因突变引起的氨基酸代谢常染色体隐性障碍，通过使神经元暴露于细胞毒性水平的苯丙氨酸（Phe），导致儿童期精神发育迟滞。最近的一项研究表明，线粒体介导的（内在）凋亡途径参与了Phe诱导的培养皮层神经元凋亡，但尚不清楚死亡受体（外在）凋亡途径和内质网应激相关凋亡是否也参与了PKU的神经变性。为了回答这个问题，我们使用特定的抑制剂来阻断大脑皮层神经元在Phe神经毒性水平下的每个凋亡途径。胱天蛋白酶-8抑制剂Z-IETD-FMK强烈减弱了Phe处理的神经元的凋亡（0.9 mM，18小时），表明Fas受体（FasR）介导的细胞死亡受体途径参与了Phe毒性。此外，Phe显著增加细胞表面Fas的表达和Fas/FasL复合物的形成。使用抗Fas抗体阻断Fas/FasL信号，可显著抑制Phe引起的细胞凋亡。相反，用柳氮芥酚阻断内质网应激诱导的细胞死亡途径对苯丙氨酸处理的皮层神经元的凋亡没有影响。这些实验表明，Fas死亡受体通路有助于Phe诱导的细胞凋亡，并提示抑制死亡受体通路可能是PKU患者神经保护的新靶点。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。内质网应激激活途径与苯丙氨酸诱导的细胞凋亡无关。
（A） eIF4阻断剂salubrinal（SAL）不能阻止苯丙氨酸诱导的细胞凋亡。在苯丙氨酸处理（0.9 mM，18 h）之前，用100 ng/ml SAL预处理细胞。TUNEL法检测细胞凋亡。（B） 苯丙氨酸诱导的细胞凋亡的定量（A）。（C） Western blotting检测到SAL预处理对苯丙氨酸处理后激活的caspase-3或caspase-12的表达没有影响。（D） （C）中带强度的量化。数值为三个独立实验的平均值±SD。*P<0.05。
图2
图2。死亡受体激活途径参与苯丙氨酸诱导的细胞凋亡。
（A） 苯丙氨酸诱导的细胞凋亡依赖于caspase活性。在苯丙氨酸（0.9 mM，18 h）和TUNEL法检测细胞凋亡之前，用20µM Z-VAD-FMK预处理细胞。（B） 苯丙氨酸诱导的细胞凋亡的定量（A）。（C） Z-VAD-FMK阻断苯丙氨酸诱导的caspase-3和caspase-8活化。在苯丙氨酸处理（0.9 mM，18 h）之前，用20µM Z-VAD-FMK预处理细胞，并通过Western blotting测定活化的caspase-3和caspase-8活化。（D） （C）中频带强度的量化。（E） Z-IETD-FMK阻断苯丙氨酸诱导的细胞凋亡。如上所述，在苯丙氨酸暴露之前，用20µM Z-VAD-FMK预处理细胞。TUNEL法检测细胞凋亡。（F） Z-IETD-FMK阻断了苯丙氨酸诱导的活化caspase-3和caspase-8表达增加。（G） 量化（F）中的带强度。数值为三个独立实验的平均值±SD。*P<0.05。
图3
图3。Fas/FasL信号传导有助于苯丙氨酸诱导的细胞凋亡。
（A） 苯丙氨酸上调了细胞表面Fas的表达，Z-VAD-FMK预处理降低了其表达。在苯丙氨酸处理（0.9 mM，18 h）之前，用20µM Z-VAD-FMK预处理细胞，并通过流式细胞术评估细胞表面Fas表达。（B） 根据免疫沉淀法评估，苯丙氨酸降低了游离Fas和FasL，Z-VAD-FMK预处理增加了游离FasL。（C） Z-VAD-FMK阻断苯丙氨酸对caspase-8的激活。Western blot检测Caspase-3和Caspase-8的活化。（D） （C）中带强度的量化。（E） Z-VAD-FMK阻断苯丙氨酸的双裂解。Western blot检测Bid的表达。（F） （E）中带强度的量化。数值为三个独立实验的平均值±SD。*P<0.05。
图4
图4。阻断Fas/FasL信号通路可防止苯丙氨酸诱导的细胞凋亡。
抗-Fas阻断苯丙氨酸诱导的细胞凋亡。在苯丙氨酸处理前2 h用1µM抗Fas抗体预处理细胞（0.9 mM，18 h），并用TUNEL法检测细胞凋亡。（B） 抗-Fas抗体阻止苯丙氨酸激活caspase-8和caspase-3。通过Western blot检测Caspase-3和Caspase-8的活化。（C） （B）中带强度的量化。数值为三个独立实验的平均值±SD。*P<0.05。
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这项工作得到了上海市科学技术委员会重大项目（No.11dz195030，Y.G.Y.）的支持（URL:网址：http://www.stcsm.gov.cn)以及中国国家自然科学基金会（81000346，Y.G.Y.）的基金资助（URL:http://www.nsfc.gov.cn). 资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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