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.2013年10月；41(19):8908-25.
doi:10.1093/nar/gkt669。 Epub 2013年8月5日。

小鼠树突状细胞junb位点的染色质环组织

塔玛拉·塞勒姆 1, 蒂芬妮·戈马尔, 法兰克法院, 加布里埃尔·莫奎特·托西, 弗雷德·里克·布罗克利, 蒂埃里·福内, 马克·皮查奇克
附属公司

小鼠树突状细胞junb位点的染色质环组织

塔玛拉·塞勒姆等。 核酸研究. 2013年10月.

摘要

junb基因在细菌脂多糖（LPS）刺激的树突状细胞（DC）中表现为即时早期基因，其瞬时转录激活是诱导炎症细胞因子所必需的。junb是一个短基因，LPS对其转录的激活依赖于NF-κB与位于其3'UTR下游的增强子的结合。在这里，我们讨论了junb转录高反应性的机制。利用转染和药理学分析来补充染色质免疫沉淀分析，以确定组蛋白、聚合酶II、负延伸因子（NELF）、DRB敏感性诱导因子（DSIF）和正转录因子b复合物的定位，我们证明junb是一个RNA Pol II paused基因，其中Pol II装载在转录起始位点域，但活性很低。此外，高盐恢复序列、染色体构象捕获（3C）和基因转移实验表明：（i）junb组织在核染色质环中，使上游启动子区和下游增强子在空间上接近；（ii）这种结构允许LPS-激活的NF-κB与增强子结合后立即在junb体上释放Pol II。因此，我们的工作揭示了DC中快速junb转录反应的新拓扑框架。此外，它还指出了NF-κB作用模式中的一个新的复杂性层。

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数字

图1。
图1。
的结构六月轨迹。转录区（1807 bp）由单个外显子（带有六月ORF为灰色）。E增强子结构域长约200 bp，位于六月聚腺苷化位点。它包含许多不同转录因子的结合位点，包括4κB位点，其中三个有助于转录（39–42）。在ChIP-、HRS-和RT-qPCR分析中，粗大的黑色水平条代表PCR扩增子，数字表示其5′端的核苷酸位置由垂直条表示。在3C的情况下，灰色细横条表示使用的扩增寡核苷酸。这些数字对应于它们的5′端，由一个竖线表示（放大器见图7）。如UCSC数据库所示，TSS的数字为+1。
图2。
图2。
LPS诱导的JunB依赖于NF-κB。(A类)的表达式6月B日蛋白质。用LPS刺激DC2.4细胞，在不同时间点用免疫印迹法检测JunB水平。显示了5个代表性实验。GAPDH被用作内部不变量控制。(B类)junb的表达mRNA。用LPS刺激DC2.4细胞指定的时间，纯化总RNA并进行RT-qPCR分析，如“材料和方法”部分所述。S26 mRNA用作不变对照。值是六个独立实验的平均值+/-S.D。(C类)BAY 11-7085抑制JunB诱导.将DC2.4细胞用IKK抑制剂BAY 11-7085预处理30分钟或用DMSO作为对照，然后用LPS处理指定的时间。用抗IκBα、-JunB-和-GAPDH抗血清进行免疫印迹分析总细胞提取物。给出的结果代表了两个独立的实验。(D类)LPS刺激后NF-κB/p65核转位.不刺激DC2.4细胞或用LPS刺激细胞1和4小时。细胞固定后，用Hoescht 33342染色细胞核，并用间接免疫荧光法检测NF-κB/p65。(电子)LPS诱导NF-κB/p65与junb结合。用LPS刺激DC2.4细胞或不进行处理，并按照“材料和方法”一节中的描述进行ChIP实验，以评估NF-κB/p65结合[NF-κ的B/p65（±LPS）]六月使用qPCR量化的位点。LPS刺激细胞中E区的结合被任意设置为1。使用抗GAPDH抗体的阴性对照[对照（±LPS）]确定显著性阈值（ST），即0.1（见“材料和方法”部分）。给出的数据是五个独立实验的平均±SD。这个六月为了清晰起见，基因座在ChIP数据下方表示。(F类)BAY 11-7085抑制junb mRNA诱导。LPS诱导的细胞在用BAY 11-7085或DMSO刺激前预处理30分钟六月mRNA定量如B所示。数据为三个独立实验的平均值±SD。(G公司)junb诱导对NF-κB位点的依赖性。用p-junb-Luc转染DC2.4细胞16小时-κB-或p-junb-Luc-κBmut报告质粒（右图）与β-半乳糖苷酶报告质粒一起用作内标物。用LPS刺激或不刺激它们8小时，然后测定荧光素酶活性（左面板）。p-junb-Luc型-κB-或p-junb-Luc-κBmut包含的−600/+2237区域六月哪里六月ORF已被萤火虫荧光素酶所取代。在p-junb-Luc中-κBmut，3号κB响应站点已被变异，使其失去功能。数据是三个独立实验±SD的平均值。
图3。
图3。
组蛋白的分布和修饰六月轨迹。(A类)junb位点上的组蛋白分布.用LPS和ChIPs刺激（+LPS）或不刺激（−LPS）的DC2.4细胞，用特异性抗H3抗体进行。用qPCR分析基因座上不同位置的相对丰度。它们根据DNA输入进行标准化，并表示为与LPS诱导细胞的比率，E域上的值任意设置为1。使用抗GAPDH抗体的阴性对照（对照±LPS）来确定显著性阈值（ST），即0.5。所提供的数据对应于六月刺激和是两个实验的平均值±SD。点与虚线相连，以使图形更清晰。(B–D类)H3修改。进行了与（A）中相同的实验，但ChIP实验是用特异性抗H3K4Me3（B）、H3K9Ac（C）和H3K9 Me3（D）抗血清进行的。B、C和D的ST分别为0.007、0.2和0.6。
图4。
图4。
Pol II的分布和修改六月轨迹。(A类)Pol II的分布。LPS刺激或不刺激DC2.4细胞，用特异性抗Pol II抗血清进行ChIP实验。ChIP程序、控制和相对丰度量化如图3所示。所示值为LPS诱导峰值时获得的值。数据为三个独立实验的平均值±SD。ST为0.45。(B类)磷酸化-Ser5 Pol II的分布。如在A中那样用特异性抗磷酸-Ser5-Pol II抗体进行实验。ST为0.4(C类)磷酸化-Ser2 Pol II的分布。在A中使用特异性抗磷酸化-Ser2 Pol II抗体进行实验。ST为0.1。
图5。
图5。
NELF和pTEF-b打开六月. (A–C)NELF-A、hspt5和CDK9的分布。如图4A所示，使用NELF-A（C）、Hspt5特异性抗体进行实验(D类)和CDK9(电子). ST分别为0.2、0.1和0.16。（D和E）依赖CDK9。DC.4细胞用DRB（或对照细胞用DMSO）预处理30分钟，并用LPS刺激或不刺激。丰富的六月如图2A和B所示，分别通过RT-qPCR（D）和免疫印迹（E）分析RNA和蛋白质。DRB处理细胞的发光图暴露更长时间，以明确JunB诱导的缺失，这说明时间0在右侧面板中更为强烈。
图6。
图6。
HSR位于六月轨迹。用LPS刺激DC2.4细胞（灰色条），或不刺激（黑色条），并按照“材料和方法”一节中的描述进行HRS分析。使用Pvu II和Sca I限制酶对该位点进行片段化。它们是我们在本试验中发现的唯一有功能的限制性内切酶。它们的识别位置用箭头表示。基因组HRS分析中分析的限制性片段用水平黑线表示，而用于量化它们的扩增子（见表1）用短灰色线表示。给出的数据是四个独立实验±SD的平均值。直方图显示了六月HRS分析中相对于阴性对照（−3963/−3016片段）富集水平的位点任意设置为1。这个阴性对照的富集水平被认为是我们实验的背景阈值。因此，富集水平>1，且其标准偏差与该值不重叠，可被视为HRS馏分中的显著富集。这些区域在图表上用星星表示+LPS对应于在最大转录活性时获得的数据。
图7。
图7。
3C分析六月轨迹。DC2.4细胞经LPS处理（+LPS）或不处理（+LP），并按照“材料和方法”一节所述进行3C定量分析。(A类)所调查的相互作用的地图。频繁切割Dde I限制性内切酶用于分离六月基因座，因为我们发现它是唯一允许对这个短基因座进行充分解析分析的限制性内切酶。在该3C分析中使用的Dde I位点（双箭头）的位置指示为c1至c6。c1被视为锚，从中可能与其他区域的六月对基因座进行评估。它们的位置相对于六月TSS取+1/-1。在这个3C实验中测试过的可能的相互作用用虚线表示，这些虚线标记为c1-c2到c1-c6。3C-qPCR中使用的锚定扩增寡核苷酸用黑色简单箭头表示，而其他引物用灰色箭头表示。(B类)junb位点3C分析的量化。数据表示包含六月TSS和六月轨迹。如前所述（50,51），相对相互作用频率通过qPCR相对于标准曲线确定。数据点代表四个独立实验的平均值±SD。在没有LPS（黑色三角形）的情况下六月观察到启动子和下游E元件（c1-4嵌合体的局部峰值）。然而，添加LPS后1小时（灰色圆圈），未发现特定的相互作用。
图8。
图8。
强转录活性对LPS刺激的反应六月启动子和增强子区域。(A类)在DC2.4细胞中转染mP-luc-E、E-mP-luc和Emut-mP-luc质粒。六月将荧光素酶基因上游或下游克隆到NF-κB反应位点突变的最小启动子（mP）、野生型E结构域和E结构域(卢克)如Aa.mP中所示，pGL3报告质粒的对应于小鼠中的位置−206/+31六月E至+2022/+2237位置。如图2G所示，转染、刺激和处理DC2.4进行荧光素酶分析。用切割mP-luc-E、E-mP-luc和Emut-mP-luc片段两侧的Ase I限制性内切酶切割质粒，以避免与质粒环状性质相关的偏见。所提供的数据是三个独立实验（Ab）的结果。(B类)携带嵌合luc/junb基因的线性和环状片段的转染.跨越最小值的DNA片段六月从p-junb-Luc纯化启动子（起始于位置−206）到E结构域末端（位置2237）-κB-和p-junb-Luc-κ图2G中使用的Bmut报告质粒。然后按照“材料和方法”一节中的描述，使用T4 DNA连接酶对其进行循环。然后用这些片段的线性和圆形亚型并行转染DC2.4细胞，并按照Ba中的描述刺激LPS，然后检测细胞裂解物中的荧光素酶活性和荧光素素酶DNA。后一种DNA分析显示实验结束时DNA亚型的数量相当。数据归一化后的荧光素酶分析结果显示在Bb中。它们对应于四个独立的实验。实验程序的细节在“材料和方法”一节中给出。
图9。
图9。
瞬时转录诱导模型六月在DC中。(A类)非刺激DC中的基础junb转录:第二次波兰战争在很大程度上是由TSS暂停的。该位点组织在一个短染色质环中，使TSS和E结构域在空间上接近。该环锚定在未定义的核内结构（NS？）上。(B类)junb的转录激活。在LPS刺激下，NF-κB被激活并与E结构域结合。这激发了Pol II的激活，并在基因体上释放。（B） junb转录激活的解析。NF-κB从E中释放，染色质环松弛。六月仍然附着在TSS上游和E域下游的核结构上。在TSS区发现一些暂停的Pol II，在E区发现一些终止转录的PolⅡ滞后一段时间。
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