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.2013年6月20日；153(7):1537-51.
doi:10.1016/j.cell.2013.05.028。

Jpx RNA通过驱逐CTCF激活Xist

沙孙 1, 布莱恩·德尔·罗萨里奥, 阿提拉·萨托, 小川由雅, Yesu Jeon公司, 珍妮·T·李
附属公司

Jpx RNA通过清除CTCF激活Xist

沙孙等。 单元格. .

摘要

在哺乳动物中，XX和XY个体之间的剂量补偿通过X染色体失活（XCI）发生。只有当存在多个X染色体时，非编码的Xist RNA才会被表达并启动XCI。目前的模型对X与常染色体比率（X:a）有依赖性，但分子因素仍不明确。在这里，我们证明X编码RNA和常染色体编码蛋白之间的分子滴定决定了Xist诱导。在前XCI细胞中，CTCF蛋白抑制Xist转录。在XCI发病时，Jpx RNA上调，结合CTCF，并从一个Xist等位基因中提取CTCF。我们证明CTCF是一种RNA-结合蛋白，通过Jpx RNA从Xist启动子中滴定。因此，Jpx通过清除CTCF激活Xist。通过分子滴定的功能拮抗揭示了长非编码RNA在表观遗传调控中的作用。

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数字

图1
图1。Jpx过度表达导致异位Xist上调
（A） 积极-消极调节西斯特.箭头，激活；钝箭、镇压。（B） 的地图Xic公司、FISH探头和Jpx（像素）转基因。Tg（Jpx）。（C） 通过qRT-PCR定量Tg（Jpx）ES细胞d4上Jpx和Xist的表达。图中显示了具有代表性的独立克隆（雄性Bs2，B2；雌性E2，E1）。表达式级别标准化为ctrl（控制克隆）。平均值±SE。另见图S1。（D） 通过RNA-DNA FISH检测d4 ES细胞中Xist的表达。FITC（绿色，探针1），Xist RNA云。Cy3（红色）、BAC5探头2个标记西克箭头，Tg插入位置。（E） 定量Xist RNA-DNA FISH可导致d4 ES细胞。显示了具有代表性的克隆。n、 样本大小。另请参见图S1。（F） 正在禁用Tsix公司增加西斯特对Jpx过度表达的反应。Tg（EF1a:Jpx）细胞的RNA-DNA FISHTsix公司TST公司/Y或Tsix公司TST公司/+d4细胞分化。为每个克隆显示一个代表性克隆。FITC（绿色，探针1），Xist RNA云。Cy3（红色）、BAC5探头2个标记西克箭头，Tg插入位置。（G） 用所示的Xist模式定量细胞（F）。（H） d4上Xist和Jpx RNA水平的qRT-PCR，归一化为亲本RNA水平Tsix公司TST公司/Y或Tsix公司TST公司/+单元格。平均值±SE。另见图S1。
图2
图2。CTCF绑定到西斯特启动子与Xist表达反相关
（A）西斯特P1和P2启动子、CTCF位点和EMSA探针。红色，CTCF图案。绿色底座，不符合CTCF图案。EMSA探针中的蓝色突变碱基。（B） DNA EMSA使用带有重组CTCF或GFP蛋白的指示探针。*，DNA-蛋白质移位。（C） 对d0、d3和d6 ES细胞进行CTCF-ChIP定量PCR分析。Rnf12，阴性对照；RS14c标准和H19，阳性对照。每个时间点至少进行三个独立实验。CTCF的平均值±SE（D）等位基因特异性ChIP西斯特P2站点位于Tsix公司TST公司/+雌性ES细胞。cas、，锥栗M。亩，小M。每个时间点进行两个独立的实验，一式三份。d0、d3和d6内螺纹的平均值±SE（E）CTCF ChIPJpx（像素）+/−ES细胞。每个时间点进行三个独立实验。平均值±SE。P（P），对每个站点的d0、d3和d6进行单向t检验。
图3
图3。CTCF过度表达导致女性特异性EB生长缺陷
（A） rtTA-表达MEF中CTCF-3xFLAG和GFP的Dox诱导双向表达。在GFP和CTCF诱导前（Dox-）和诱导后（Dox+）的相比较显示正常细胞形态。显示FLAG和CTCF免疫荧光。（B） 代表性转基因克隆的Western blot显示，在d0 ES细胞（左面板）和d1雌性ES细胞（右面板）中，CTCF-3xFLAG受到dox诱导。（C） CTCF过度表达导致女性特异性生长缺陷，直至第13天。明亮的视野图像显示EB生长。GFP表明转基因（CTCF）过度表达。注意，雄性而非雌性的GFP阳性细胞在Dox+条件下生长。诱导后，GFP信号局限于EB中心。（D） 雌性对照品ctrl#5携带沉默的转基因并正常生长，而过表达的克隆品#2和#1则无法生长。显示了d5个图像。
图4
图4。CTCF过表达以时间敏感的方式抑制Xist诱导
（A） CTCF过表达阻断Xist的上调。左面板：d6雌性转基因细胞上的RNA-DNA FISH±Dox。绿色，Xist RNA。红色，西克轨迹。中间面板：两个克隆体d6上Xist云±Dox的定量。只有完整的西斯特云被评分（没有精确的信号）。右侧面板：d4细胞上Oct4、Bmp4和Xist RNA的qRT-PCR。平均±SE。（B）EB分化d2-d4之间的敏感时间窗。Dox在时间进程分析期间应用于指定的日期（红色条）。d11显示了相位对比度和相应的GFP图像。
图5
图5。Jpx RNA通过滴定CTCF中和生长缺陷
（A） 过度表达Jpx RNA可以挽救CTCF过度表达引起的生长缺陷。微分d8上显示的相位对比度和相应的GFP信号。（B） d8上的RNA-DNA FISH。绿色，Xist RNA；红色，西克轨迹。鱼的数量显示在右侧面板中。（C） d8上Jpx、Xist和Ctcf RNA的qRT-PCR，归一化为Tg（TRE:Ctcf）Dox–（设置为1.0）。三份的平均值±SE*p<0.05（单向t检验）。（D） western blotting显示CTCF-FLAG诱导。
图6
图6。Jpx RNA与CTCF结合并从Xist启动子中提取CTCF
（A） UV-RIP使用抗FLAG抗体，然后在d12雌性ES细胞中进行qRT-PCR。对Jpx外显子1-2（E1-E2）、外显子4-5（E4-E5）、亲环素对照组和Xist进行qRT-PCR。同时处理紫外线阴性对照。平均值±标准误差。（B）使用从野生型雌性MEF中提取的总RNA进行体外RNA下拉。将纯化的FLAG-GFP或-CTCF与RNA一起孵育。通过qRT-PCR定量下拉。平均值±SE（C）RNA EMSA.*，RNA蛋白移位。左侧面板：Jpx RNA探针（383 nt），纯化CTCF或GFP的数量增加。右面板：带Jpx和383 nt Xist控制探头的CTCF。（D） 使用Jpx亚型的RNA EMSA。E1–E3，383 nt（全长）。截短的E1–E2，220 nt或E2–E3，183 nt。E4–E5是可供选择的3′端，不需要西斯特激活（Lee等人，1999年）。（E） 滴定EMSA显示Jpx RNA和P2 DNA竞争结合CTCF。一个0.5 pmol的Jpx探针，带有2 pmol冷P2或P2 mut 80 bp的DNA竞争物。*，RNA蛋白移位。比较绿色/红色箭头标记的车道。（F） 相互滴定：P2 DNA和Jpx RNA竞争结合CTCF。将CTCF和P2 DNA探针与冷RNA竞争物混合在0.1、0.2、0.4和0.8μg，DNA-蛋白质移位。左面板：带有冷Jpx RNA或Xist RNA竞争物。右面板：使用全长Jpx与截短的Jpx RNA竞争对手。比较红色箭头标记的车道。
图7
图7。Jpx RNA和CTCF在西斯特体内促销员
（A） 在d0时转基因雌性ES细胞的CTCF-ChIP分析显示体内滴定。富集值根据标准化H19型控制并与Tg（TRE:Ctcf）Dox进行比较–（设置为1.0），使用单向t检验（*p<0.05）。每个细胞系至少进行三次独立实验。平均值±SE.（B）滴定和调制西斯特荧光素酶分析显示，所示基因型的d4雌性ES细胞中P1+P2转录。的地图西斯特'秒荧光素酶结构显示5′端。左面板：通过Tg（EF1 a:Jpx）实现Jpx过度表达Jpx（像素）+/-变种人救援西斯特启动子活性。中间面板：通过改变P2取消救援。右面板：过度表达CTCF引起的转录抑制通过突变P2得到缓解。Dox通过Tg诱导CTCF+、CTCF过度表达（TRE:CTCF）。每个实验至少进行两次独立转染和≥4次独立荧光素酶测量。平均值±SE.*p<0.05**p＜0.01。（两两比较中的一对t检验表明。）（C）支持Jpx-CTCF滴定模型的数据总结。（D） 模型：Jpx RNA激活西斯特通过将CTCF从西斯特发起人。（E） X：A滴定：BF，封闭因子。CF，能力因素。高炉的精确成分及其Xic公司绑定站点当前未知。CTCF可能是BF的一个组成部分。Jpx只有在过量2倍时才形成CF。（F） 非线性动力学是滴定模型的一个必要特性，很可能受到高度协同作用的影响。乙状结合曲线可以使因子浓度的微小变化引发较大的生物效应（例如，全部或全部不结合），这是线性动力学无法实现的（灰色虚线）。
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中的注释

  • 表观遗传学：通过滴定使X失活。
    斯托尔H。 斯托尔H。 Nat Rev基因。2013年8月；14(8):518. doi:10.1038/nrg3538。Epub 2013年7月2日。 Nat Rev基因。2013 PMID：23817312 没有可用的摘要。

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引用人

  • 哺乳动物X的基因剂量补偿。
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