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.2013年4月30日；110(18):7246-51.
doi:10.1073/pnas.1302298110。 Epub 2013年4月15日。

La Crosse Orthobunya病毒核蛋白包裹基因组RNA的结构基础

胡安·雷盖拉 1, Hélène Malet公司, 弗里德曼·韦伯, 斯蒂芬·库萨克
附属公司

La Crosse Orthobunya病毒核蛋白包裹基因组RNA的结构基础

胡安·雷盖拉等。 美国国家科学院程序. .

摘要

分段负链RNA病毒（如正粘病毒、Arena病毒和Bunya病毒）的核蛋白（NP）包裹基因组病毒RNA，与聚合酶一起形成核糖核蛋白颗粒（RNP），它既是复制和转录的模板，被包装成新的病毒。在这里，我们描述了无RNA和四聚体形式的La Crosse Orthobunyavirus NP的晶体结构，它们与单链RNA结合。La Crosse Orthobunyavirus NP是一种螺旋状蛋白质，具有不同于其他bunyaviruss属NP的折叠。它将11个RNA核苷酸结合在两个叶之间带正电的凹槽中，铰接的N端和C端臂介导寡聚化，允许可变的蛋白质-蛋白质界面几何形状。寡聚化和RNA结合由保守的正丁香病毒属残基介导。在双对称四聚体中，44个核苷酸在NP-NP界面处以急弯的形式结合在一个闭合环中。RNA在一个连续的内部凹槽中基本上是不可接近的。从病毒粒子释放的RNP的电子显微镜显示，它们能够形成或多或少紧凑的不规则螺旋结构层次。我们讨论了平面四聚体NP-RNA结构如何与极丝相关，极丝在超螺旋后可以被包装成病毒粒子。这项工作深入了解了布尼亚病毒NP的RNA包被和保护功能，但也强调了RNP动态重排的必要性，以使聚合酶能够访问模板RNA。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
重组LACV NP特性。(A类)纯化NP四聚体的凝胶过滤大肠杆菌用核糖核酸酶A和0.4M硫氰酸盐处理前后（分别为不连续线和连续线）。每个峰值的多角度激光光散射测量值分别以深灰色线和浅灰色线显示。治疗前观察到的质量为131 KDa，对应于带有结合RNA的四聚体。治疗后，有两种126 KDa（带有较短RNA的四聚体）和26 KDa（单体）。(B类)从中纯化的四聚体的RNA含量大肠杆菌经过各种处理。通道1，从直接纯化的四聚体中分离的RNA大肠杆菌; 第2车道，RNase A处理后；泳道3，用RNase A和0.4M硫氰酸盐处理后。大肠杆菌-长度为45-60的衍生RNA优先与四聚体结合。尽管核糖核酸酶可能在NP–NP界面上有一定的可接近性，但高达约45个nts的RNA受到保护，不会被降解。硫氰酸盐破坏四聚体的稳定性，使不与单体NP紧密结合的RNA更容易接近(C类)未经处理的四聚体用1%硅钨酸钠负染的EM图像。黑线表示20 nm。箭头指向单个四聚体。(D类)天然丙烯酰胺凝胶电泳迁移率变化分析32P标记的PH60病毒RNA与冷竞争对手RNA在室温下与单体NP孵育1小时。通道1，仅标记PH60；通道2，标记PH60，仅与单体N孵育；通道3–6，用12µM标记PH60，并连续三倍稀释冷PH60；通道7–10，与冷富铀RNA相同。
图2。
图2。
无RNA LACV NP的结构(A类)LACV NP的彩虹染色带状表示N个-（蓝色）至C端子（红色）。杂乱的铰链区域是点状的。指示的二级结构元素与图3中的序列对齐一致。(B类)LACV NP的静电表面，正负电荷分别为蓝色和红色(C类)N个-臂齐聚界面。这个N个-手臂（蓝色棍子）在下一个蛋白质（绿色，表面透明）的身体上形成与β2平行的β链（βN）。三个分子间主链氢键显示为黄色虚线。Asp8和Arg40形成盐桥。残基Leu4、Phe6、Pro63和Phe65形成疏水簇。Asn45侧链与Tyr7的主链形成两个氢键。(D类)C臂齐聚界面。C臂两亲性螺旋α11一侧的疏水残基，特别是Leu219、Ala223、Phe226、Leu227、Phe230和Ile232（红色棒），与下一个蛋白质（具有透明表面的绿色带和棒）体上的疏水口袋结合由螺旋体α7–α10（尤其是Leu161、Ile165、Leu178、Leu 182、Trp194、Met195、Ile 202和Leu206）的残基形成。
图3。
图3。
代表性序列比对布尼亚病毒属NP。LACV NP的二级结构如上所示，关键功能残基如图所示着色。
图4。
图4。
四聚体LACV NP中的RNA结合模式(A类)LACV NP四聚体与44 nts RNA复合体的卡通表示，显示为青色和橙色条。图中的伪两倍对称轴使得单体A（深蓝色）和C（浅蓝色）以及B（绿色）和D（柠檬色）等效。(B类)LACV NP–RNA四聚体晶体结构二维投影的对应性(左侧，过滤至20℃）和EM级平均值大肠杆菌与细菌RNA结合(赖特). 显示与俯视图和斜视图（最多30°）相对应的平均等级；未观察到侧视图。(C类)LACV NP–RNA四聚体中的RNA构象显示与每个单体结合的S形骨架构象和NP–NP界面处的尖锐扭结。A–B和C–D接口处的顶部和底部弯头不如D–A和B–C接口处的左右弯头尖锐(图S3A类). 虽然在U11–U12、U22–U23和U33–U34之间，跨NP–NP界面的RNA骨架连续性很明显，但U43–U44的电子密度和与U1的连接不太好，这与RNA实际上有45个nts的事实一致，比占据所有四个NP所需的多出一个nts。(D类–F)NP–RNA四聚体复合物的表面表征的正交视图显示，RNA主要埋藏在内部凹槽中，只有部分溶剂主要进入主干。这个N个-和C形臂高亮显示。(G公司)蛋白质-RNA相互作用示意图，突出显示碱基的堆叠排列。(H（H）)NP–RNA与11nts RNA相互作用的棒状表示，以青色显示，相互作用的蛋白质残基以黄色显示。假定的氢键显示为绿色虚线。
图5。
图5。
铰接的N个-C形臂可以灵活包装基因组。(A类)NP–RNA四聚体中四个单体的叠加，如图4所示着色，显示了N个-A/C和B/D对的C臂。(B类)来自无RNA（红色）、四聚体（链A、蓝色和B、绿色）的LACV NP单体的叠加，以及P（P）41螺旋形（橙色）。这个N个-螺旋形和C形臂分别朝向BN个-臂和A C臂。无RNA臂（导致晶体中的网络扩展）与其他观察到的构象都不同。(C类)NP在a4中的分子堆积1在P4中观察到的螺旋1晶体形状，显示螺旋的宽度和螺距。RNA被建模为螺旋内表面上的橙色管。通过将来自四聚体的B亚基及其结合的11nt RNA叠加在每个螺旋原聚体的核心上来定位连续的11nt RNA片段。在不进行任何调整的情况下，RNA片段的近连续性表明，四聚体中观察到的RNA结合模式与延伸螺旋内更长的RNA结合相兼容。(D类)4的近端视图1螺旋NP–RNA模型显示了与四聚体投影的相似性（图4A类). (E类)用2%醋酸铀负染后，用电子显微镜检查来自被破坏病毒的LACV RNP。所示RNP的尺寸为～160×75 nm。RNP是灵活的，但在某些区域显示的区域具有明显的螺旋特征，以绿色突出显示，并以特写显示。(F类和G公司)净化LACV RNP显示部分(F类)或完成(G公司)超螺旋。在G公司RNP尺寸为～60 nm长×18 nm宽。(H（H）)在37°C孵育后，RNP部分解开，并显示长而细的项链，代表与RNA结合的单个NP。三个与RNA结合且蛋白间距离为～50º的NP的特写。
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中的注释

  • 正布尼亚病毒核蛋白对基因组的包被。
    郑伟，陶永杰。 郑伟等。 美国国家科学院院刊2013年5月28日；110(22):8769-70. doi:10.1073/pnas.1306838110。Epub 2013年5月21日。 美国国家科学院院刊，2013年。 PMID：23696659 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

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