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.2013年5月24日；288(21):14936-48.
doi:10.1074/jbc。M112.434597。 Epub 2013年4月5日。

垂体腺苷酸环化酶激活多肽（PACAP）通过激活核因子κB（NF-κB）途径促进PC12细胞的存活和神经发生：参与细胞外信号调节激酶（ERK）、钙和c-REL

命运之爱Manecka 1, 萨达尔·费萨尔·马哈茂德, 卢卡·格鲁莫拉托, 伊莎贝尔·利赫曼, 尤塞夫·阿诺阿
附属公司

垂体腺苷酸环化酶激活多肽（PACAP）通过激活核因子κB（NF-κB）途径促进PC12细胞的存活和神经发生：参与细胞外信号调节激酶（ERK）、钙和c-REL

命运之爱Manecka等。 生物化学杂志. .

摘要

垂体腺苷酸环化酶激活多肽（PACAP）是一种促进神经元存活和突起生长的营养因子。然而，所涉及的信号通路和转录机制尚未完全阐明。我们之前的研究旨在描述PACAP分化PC12细胞的转录组特征，结果显示编码NF-κB转录因子p100/p52亚单位的核因子κB2（NF-κ）基因的表达增加。在此，我们研究了NF-κB通路在PACAP促进神经元分化中的作用。我们首先表明，NF-κB通路阻断后，PACAP驱动的PC12细胞存活和神经炎延伸受到抑制。PACAP刺激c-Rel和p52 NF-κB亚单位基因表达和核移位，而c-Rel下调抑制神经肽诱导的细胞存活和神经发生。ERK1/2和Ca（2+）阻滞剂抑制PACAP诱导的c-Rel核转位。此外，神经肽刺激NF-κB p100亚单位加工成p52，表明NF-κ的B替代途径激活。综上所述，我们的数据显示，PACAP通过激活NF-κB通路促进PC12细胞的存活和神经生成，最有可能是通过涉及ERK1/2激酶、Ca（2+）和c-Rel/p52二聚体的经典和替代信号级联。

关键词：钙；细胞分化；细胞存活；ERK；NF-κB；神经突起生长；神经肽；神经营养因子；PACAP；PC12细胞。

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数字

图1。
图1。
PS-1145对PACAP调节PC12细胞活力和caspase活性的影响。 A类，PC12细胞暴露于PACAP（100 n米)在有无PS-1145（10μ米)用MTT法评估细胞存活率。B类，PC12细胞暴露于PACAP（100 n米)在没有或存在PS-1145（10μ米)用Apo-ONE试剂盒评估PC12细胞中Caspase-3/7的活性，并以每分钟相对荧光单位（RFU）表示。数据表示为平均值±S.E(误差线)相对于控制值(n个= 6). *,对< 0.05; **,对<0.01（曼希特尼U型测试）。实验重复了三次，结果相似。
图2。
图2。
PS-1145对PACAP诱导的神经突起生长的影响。 A类，细胞未经处理或用PACAP处理（100 n米)有无PS-1145（10μ米)持续6、24或48小时。B类和C，100个细胞的轴突数量(B类)和神经突起长度(C)使用共焦显微镜和ImageJ软件进行测定。数据表示为平均值±S.E(误差线)相对于控制值(n个>30).比例尺，100微米**，对<0.01；***，对<0.001（学生的t吨测试）。实验重复了三次，结果相似。
图3。
图3。
PACAP效应的动力学分析（100 n米)和TNF-α（10 n米)NF-κB亚单位的mRNA水平。用PACAP处理PC12细胞(A类,C,E类、和G公司)或TNF-α(B类,天,F类、和H（H）)对于指定的时间和RelA(A类和B类)，c-相对(C和天)，第50页(E类和F类)和第52页(G公司和H（H）)实时PCR定量基因表达。数据表示为平均值±S.E(误差线)相对于控制值(n个= 4). *,对< 0.05; **,对<0.01；***，对<0.001（曼-惠特尼U型测试）。实验重复了两次，结果相似。
图4。
图4。
PACAP和TNF-α对NF-κB亚单位亚细胞定位的影响。 A类，PC12细胞与PACAP孵育（100 n米)或TNF-α（10 n米)持续2 h，然后使用针对不同NF-κB亚单位的抗体和荧光结合二级抗体进行免疫细胞化学。用DAPI标记Nuclei。B–F类，RelA的细胞核和细胞质荧光(B类)，版本B(C)，c-相对(天)，第50页(E类)和第52页(F类)使用ImageJ软件进行测量。数据表示为平均值±S.E(误差线)相对于控制值(n个>30). **,对<0.01；***，对<0.001（学生的t吨测试）。实验重复了三次，结果相似。G公司，用PACAP处理PC12细胞（100 n米)或TNF-α（10 n米)持续2h，制备细胞质和细胞核组分。使用抗RelA和抗RelB抗体进行Western blotting，以评估亚单位的核移位。拉明A被用作核分数的标记。细胞质组分和核组分分别称为细胞。和核.
图5。
图5。
c-Rel和RelA沉默对NF-κB亚单位mRNA和蛋白水平的影响。在转染PC12细胞48小时后，分析对照、c-Rel或RelA siRNA、c-Rel和RelA的表达。A类和B类，c-相对(A类)和RelA(B类)实时PCR定量基因表达。数据以平均值±标准误差表示(误差线)相对于控制值(n个= 4). *,对<0.05（曼希特尼U型测试）。实验重复了三次，结果相似。C和天，使用针对c-Rel的抗体进行免疫细胞化学(C)和Rel-A(天)亚单位之后是荧光结合二级抗体。细胞核用DAPI标记。数据表示为平均值±S.E(误差线)相对于控制值(n个>30）。***，对<0.001（学生t吨测试）。实验重复了三次，结果相似。E类使用ImageJ软件测量c-Rel和RelA的细胞质和核荧光。siRNA处理后RelA的蛋白质印迹。α-管蛋白被用作负荷控制。
图6。
图6。
c-Rel和RelA沉默对PACAP刺激的PC12细胞活性的影响。用对照c-Rel或RelA siRNA转染PC12细胞后24小时，用PACAP（100 n）处理PC12细胞米)用MTT法评估细胞活力。数据表示为平均值±S.E(误差线)相对于控制值(n个= 6). *,对<0.05（曼希特尼U型测试）。实验重复了两次，结果相似。
图7。
图7。
c-Rel和RelA沉默对PACAP诱导的神经突起生长的影响。用对照c-Rel或RelA siRNA转染PC12细胞后24小时，用PACAP（100 n）处理PC12细胞米)48小时，每个细胞的突起数量(A类)和神经突起长度(B类)通过共焦显微镜和ImageJ分析确定。数据以平均值±标准误差表示(误差线)相对于控制值(n个>30). *,对< 0.05; **,对<0.01（学生的t吨测试）。实验重复了三次，结果相似。
图8。
图8。
MEK抑制剂对PACAP诱导的c-Rel核转位的影响。 A类和B类，用U0126（10μ米,A类)或PD98059（50μ米,B类)在不存在或存在PACAP的情况下持续1小时（100 n米)持续2小时。使用针对NF-κB的c-Rel亚基的抗体进行免疫细胞化学，然后使用荧光染料偶联的第二抗体。用DAPI标记Nuclei。C和天使用ImageJ软件测量c-Rel的核荧光。数据表示为平均值±S.E(误差线)相对于控制值(n个>30). ***,对<0.001（学生的t吨测试）。实验重复了三次，结果相似。
图9。
图9。
钙的作用2+活化抑制剂对PACAP诱导的c-Rel核移位的影响。 A类和B类用氯化镍预处理PC12细胞2（3米米,A类)或EGTA（0.3米米,B类)在没有或存在PACAP的情况下持续1小时（100 n米)使用针对NF-κB的c-Rel亚单位的抗体和荧光结合的二级抗体进行免疫细胞化学。用DAPI标记Nuclei。C和天使用ImageJ软件测量c-Rel的核荧光。数据表示为平均值±S.E(误差线)相对于控制值(n个>30). ***,对<0.001（学生的t吨测试）。实验重复了三次，结果相似。
图10。
图10。
蛋白激酶抑制剂对PACAP诱导的c-Rel核转位的影响。 A类和B类用白屈菜红碱（Chel，5μ米,A类)或沃特曼（麦汁，0.5μ米,B类)在不存在或存在PACAP的情况下持续1小时（100 n米)持续2小时。使用针对NF-κB的c-Rel亚基的抗体进行免疫细胞化学，然后使用荧光染料偶联的第二抗体。用DAPI标记Nuclei。C和天使用ImageJ软件测量c-Rel的核荧光。数据表示为平均值±S.E(误差线)相对于控制值(n个>30). ***,对<0.001（学生的t吨测试）。实验重复了三次，结果相似。
图11。
图11。
PACAP对ERK激活的影响。用U0126（10μ米)，PD98059（50μ米)，或氯化镍2（3米米)用PACAP孵育前1小时（100 n米)用磷酸化ERK（P-ERK）抗体进行5分钟的免疫印迹，并用α-微管蛋白抗体作为负荷对照。
图12。
图12。
PACAP对p100成熟的影响。经或未经PACAP处理的细胞的蛋白质提取物（100 n米)用Western blotting分析p100蛋白的加工过程。使用ImageJ软件测量相对强度。
图13。
图13。
示意图总结了PACAP诱导PC12细胞中NF-κB活化所涉及的假定细胞内事件。PACAP的作用可能通过Epac或新的cAMP传感器触发NIK的cAMP-依赖性激活（26）。反过来，NIK将激活IKK复合物的IKK1亚单位，该复合物由催化型IKK1-同型二聚体组成，允许产生c-Rel/p52二聚体，这些二聚体由IκB蛋白维持在细胞质中。NIK还通过激活ERK1/2激酶来激活IKK2，这是一种异二聚体IKK复合物的亚单位，包括催化型IKK1和IKK_2亚单位以及调节蛋白NEMO。MAP激酶途径也可被钙激活2+动员。激活的IKK2诱导IκB及其核转位的c-Rel/p52释放，以调节PACAP诱导的存活和神经发生相关基因的表达。
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