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.2013年3月6日；77(5):886-98.
doi:10.1016/j.neuron.2013.01.012。

与线粒体缺陷相关的异常雪旺细胞脂质代谢导致轴突变性和神经病变

安德烈·维亚德 1, Yo Sasaki先生, Sungsu Kim先生, 艾米·斯特里克兰, 凯西·S·工人, 葵阳, 理查德·格罗斯, 杰弗里·米尔布兰特
附属机构

与线粒体缺陷相关的异常雪旺细胞脂质代谢导致轴突变性和神经病变

安德烈·维亚德等。 神经元. .

摘要

线粒体功能障碍是外周神经病变的常见原因。人们已经花了很多精力来研究神经元/轴突线粒体所起的作用，但外周神经胶质细胞（雪旺细胞[SCs]）中的线粒体缺陷如何导致外周神经疾病仍不清楚。在这里，我们研究了继发于SC线粒体功能障碍（Tfam-SCKOs）的周围神经病变小鼠模型。我们发现，SC线粒体的破坏通过血红素调节抑制剂（HRI）激酶的作用激活了不适应的综合应激反应（ISR），并导致脂质代谢从脂肪酸合成转向氧化。SC脂质代谢的这些变化导致重要髓磷脂脂质成分的耗竭，以及脂肪酸β-氧化中间产物——酰基肉碱（ACs）的积累。重要的是，我们发现AC从SC释放出来并诱导轴突变性。因此，适应性不良的ISR和SC脂质代谢改变是线粒体相关周围神经病的潜在病理机制。

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图1
图1。SC线粒体功能障碍导致渐进性退行性周围神经病变，与能量消耗无关
（A）1个月大的Ctrl和Tfam-SCKO坐骨神经横截面的电子显微照片，描绘了Remak束的早期结构异常（SC围绕多个无髓鞘轴突；箭头）和无髓鞘轴索的退化（星号）。A、 轴突；N、 SC核；C、 SC细胞质。比例尺500 nm。（B、C）不同年龄段的Tfam-SCKO和Ctrl坐骨神经横截面的托洛定蓝染色塑料切片（B）和每根神经有髓剖面总数的量化（C）显示，大的有髓轴突进行性退化和脱髓鞘开始于3-4个月龄。箭头（B）表示轴突被异常薄的髓鞘包围，这是脱髓鞘的迹象。箭头（C）表示在随后的实验中使用的所有小鼠的病理进展点；请注意，在这个年龄段，神经只表现出有限的早期病理变化，轴突丢失和脱髓鞘程度很低。N=每个基因型在每个年龄段有4只小鼠*P<0.01比例尺25μm。（D）2个月大的Tfam-SCKO神经中的腺苷酸能量电荷显示，与Ctrl神经相比，Tfam缺陷SCs的能量水平仅略有下降。N=8只小鼠/基因型*P<0.01（E）免疫印迹分析和带强度定量显示，2个月大的Tfam-SCKO神经中能量传感器AMPK的磷酸化（激活）没有增加，表明能量耗竭不太可能是这些小鼠神经病理的驱动因素。N=每个基因型4只小鼠。
图2
图2。SC线粒体功能障碍激活不适应综合应激反应（ISR）
（A）与qRT-PCR测定的Ctrl相比，SC线粒体功能障碍上调了2个月大Tfam-SCKO神经中ISR靶基因的表达。自动变速箱4，激活转录因子4；数据3，DNA损伤诱导转录物3；ASNS公司天冬酰胺合成酶；MTHFD2型，亚甲基四氢叶酸脱氢酶；TRIB3协议，三元同源物3。N=每个基因型5只小鼠*P<0.05（B）免疫印迹分析显示，2个月大的Tfam SCKO与Ctrl神经中eIF2α的磷酸化增加，证实了ISR的激活（C）用线粒体抑制剂抑制培养SCs的线粒体呼吸可上调ISR靶基因的表达，如qRT-PCR所测。N=来自3个独立实验的重复井*P<0.05。（D）免疫印迹分析表明，将线粒体抑制剂CCCP应用于培养的SCs会增加eIF2α的磷酸化，表明抑制线粒体电子传递链会激活ISR。
图3
图3。SCs中线粒体功能障碍诱导的ISR激活由不依赖于ER应激的血红素调节抑制剂（HRI）激酶介导
（A）对2个月大的Ctrl和Tfam-SCKO神经（每个基因型3只独立的小鼠）中ER-stress传感器Perk和UPR-induced分子伴侣BiP/Grp78的磷酸化（激活）状态的免疫印迹分析显示没有差异，表明SC线粒体缺陷后的ISR激活不涉及ER-stress。作为外植体培养的坐骨神经经膜霉素（Tun）治疗，可作为ER应激的阳性对照。车辆，车辆。（B）凝胶显示2个月大的Tfam-SCKO神经或经线粒体抑制剂治疗的SCs中ER-stress传感器Ire-1激活下游没有Xbp-1剪接，证实线粒体紊乱诱导的ISR激活与ER-stress无关。对培养的SCs或作为外植体培养的坐骨神经进行膜霉素治疗，作为ER应激的阳性对照。（C）用5μM CCCP处理3小时以抑制线粒体呼吸的指示eIF2α激酶（HRI、PKR、PERK、GCN2），免疫印迹分析表达shRNA的3T3细胞中的eIF2β磷酸化。在线粒体呼吸受到抑制后，HRI（而不是GCN2、PKR或PERK）的敲除足以阻止eIF2α磷酸化，表明HRI在这一过程中的特殊作用。（D）通过密度测定法定量免疫印迹，如（C）所示。N=3个独立实验。（E）用5μM CCCP抑制3T3细胞线粒体呼吸6小时后诱导ISR介体DDIT3/CHOP的免疫印迹分析，其中指示的eIF2a激酶（HRI、PKR、PERK、GCN2）的表达被shRNA敲除。HRI的敲除（但不包括GCN2、PKR或PERK）足以阻止线粒体呼吸抑制后eIF2α磷酸化下游的DDIT3/CHOP诱导。
图4
图4。SC线粒体功能障碍导致脂质代谢从脂质生物合成转向脂肪酸氧化
（A）通过微阵列分析确定的2个月大的Tfam-SCKO神经中差异表达的mRNA丰富了参与脂质代谢途径的基因。显示了Tfam-SCKO神经差异表达基因中最显著富集的10条通路。（B）qRT-PCR分析证实，在2个月大的Tfam-SCKO与Ctrl神经中，一些与脂质合成相关的酶被下调。SREBP1号机组固醇调节元件结合转录因子1；FASN公司脂肪酸合成酶；HMGCR公司，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶；ACLY公司，ATP柠檬酸裂解酶；ACC2公司，乙酰辅酶A羧化酶β（主要定位于线粒体）。N=每个基因型5只小鼠*P<0.05。（C）图示了乙酰辅酶A羧化酶（ACC）对脂肪酸合成与氧化之间平衡的调节，以及ACC的磷酸化状态如何改变脂肪酸合成。（D、E）免疫印迹分析（D）和带强度定量（E）显示2个月大的Tfam-SCKO神经中ACC磷酸化增加。磷酸化抑制了脂质合成与氧化之间平衡的中央调节器，表明（连同基因表达结果）脂质代谢从新的脂质合成转向线粒体功能障碍后SC中脂质氧化增加。N=每个基因型4只小鼠*P<0.05。
图5
图5。线粒体功能障碍引起的脂质代谢异常导致髓磷脂脂质成分耗竭，并破坏Tfam-SCKO神经中的轴突-SC相互作用
（A、B）脂质组学分析显示，在2个月大的Tfam SCKO与Ctrl神经中，两种关键的髓鞘脂质成分脑苷脂（A）和硫苷脂（B）早期显著耗竭。N=每个基因型5只小鼠*P<0.05。(C、 D）2个月大的Ctrl和Tfam-SCKO神经中的淋巴结结构用抗淋巴结（Nav1.6，C）、偏执型（Caspr，C和D）和并排型（Kv1.2，D）标记物的抗体进行免疫染色，显示电压门控钠通道（Nav1.6、C）的正常聚集，但电压门控钾通道簇的异常定位或丢失（Kv12，D）脑苷类和磺胺类药物耗竭后大量淋巴结周围。星号标记缺少Kv1.2星团（D）。比例尺50μm。(E）量化2个月大的Ctrl和Tfam-SCKO神经中的节点数量，如（D）中所示，Kv1.2簇完整（两者都有）或节点一侧（一半）或两侧缺少Kv1.2集群（无），证实了髓磷脂成分减少后，Tfam-SCAKO和Ctrl神经中离子通道簇的破坏。N=每个基因型在每个年龄段有3只小鼠*P<0.05。（F）2个月大的Tfam-SCKO坐骨神经的纵向电子显微照片显示，与Ctrls（节段线）相比，节点间隙增大，表明Ranvier节点周围的轴-胶质接触异常。N、 节点；P、 偏执狂；箭头，偏执循环。比例尺2μm。（G）2个月大的Tfam-SCKO坐骨神经的横截面电子显微照片显示，与Ctrls相比，大量轴突已脱离髓鞘（星号），表明脑苷类和磺胺类药物缺乏后，Tfam-SCAKO的轴-胶质粘附受到破坏。比例尺2μm。（H，I）对2个月大的神经（H）进行免疫印迹分析和定量（I）表明，在神经髓鞘碱性蛋白（MBP）表达下降之前，硫苷和脑苷的耗竭是导致后期脱髓鞘的潜在驱动因素。N=3只小鼠/基因型。
图6
图6。线粒体功能障碍继发的SC积累和释放酰基肉碱脂肪酸β-氧化中间产物破坏轴突钙稳态和稳定性
（A、B）。脂质组学分析显示，长链酰基肉碱（总量，a）显著积累，影响2个月大的Tfam-SCKO与Ctrl神经中大多数长链分子物种（B）。N=每个基因型5只小鼠*P<0.05。（C）描绘线粒体中脂肪酸β-氧化的图表。长链脂肪酸转化为酰基肉碱，然后穿梭到线粒体基质，即β-氧化位点，在那里通过四个酶反应的重复循环进行氧化。红色文本表示NAD/NADH的更改比率+Tfam-SCKO神经。红星表明线粒体功能障碍后，脂质中间产物在Tfam-SCKO神经中积聚。Cpt1和Cpt2：肉碱棕榈酰转移酶1和2；外T：长链脂肪酸转运蛋白；T内：肉碱-酰基肉碱转氨酶；辅酶A：辅酶A。（D）通过质谱测定，移植2个月大的Tfam-SCKO神经而非Ctrl神经会将长链酰基肉碱释放到周围的培养基中。N=6只小鼠/基因型*P<0.05。（E）钙荧光强度增加的图像2+急性（30分钟）应用棕榈酰肉碱（PC）（一种在Tfam-SCKO神经中高度增加的酰基肉碱物种）后的染料Fluo-4表明，这种脂质中间体可以破坏轴突钙稳态。注意，当应用相应的游离脂肪酸（棕榈酸酯，P）时，没有看到类似的变化。比例尺，100μm。（F、G）棕榈酰肉碱对Fluo-4强度（F）和Ca影响的量化2+起泡（G）表明，这种脂质中间体对轴突钙的影响是剂量依赖性的，并且对酰肉碱具有特异性；在相同浓度下施用相应的游离脂肪酸没有产生类似的效果。N=三个代表性试验中的一个试验中的三个重复孔*P<0.05。（H）慢性应用25μM棕榈酰肉碱（PC）9天后，轴突变性逐渐增加的图像。比例尺，100μm。（一）25μM棕榈酰肉碱（PC）慢性治疗后轴突变性的量化显示轴突变性指数显著、渐进性增加。N=3个独立实验，每个条件下4-6口井*P<0.05。
图7
图7。SC脂质代谢改变伴脂质中间产物毒性积聚导致线粒体相关周围神经病的轴突变性和脱髓鞘
描述不适应综合应激反应的激活以及脂质代谢从脂质合成向脂质氧化转变（继发于SC线粒体功能障碍）如何导致周围神经病变的拟议模型的图表。HRI：血红素调节抑制剂激酶；CB：脑苷类；ST：硫化物；AC：酰肉碱
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