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.2013年3月22日；288(12):8750-8761.
doi:10.1074/jbc。M112.414128。 Epub 2013年1月30日。

MicroRNA-31通过直接靶向蛋白激酶Cε（PKCepsilon）使人乳腺细胞对凋亡敏感

辛迪·科纳 1, Ioanna Keklikoglou女士 1, 克里斯蒂安·本德 1, 安吉丽卡·沃纳 1, 埃瓦德·穆斯特曼 1, 斯特凡·维曼 2
附属公司

MicroRNA-31通过直接靶向蛋白激酶Cε（PKCepsilon）使人乳腺细胞对凋亡敏感

辛迪·科纳等。 生物化学杂志. .

摘要

微RNA转录后调节基因表达，从而有助于调节多种复杂和疾病相关的细胞表型，包括细胞增殖、细胞运动、凋亡和应激反应。在乳腺癌细胞系统中，miR-31被证明可以抑制细胞迁移、侵袭和转移。在此，我们将miR-31的增强表达与抑制致癌NF-κB通路联系起来，从而支持这种微RNA的抑瘤功能。我们确定蛋白激酶Cε（由PRKCE基因编码的PKCε，细胞凋亡增强，MCF10A乳腺上皮细胞和MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞对电离辐射和化疗的敏感性增加。从机制上讲，我们将这种对抗癌治疗的敏感性归因于PRKCE介导的抗凋亡因子BCL2的下调。在临床乳腺癌样本中，BCL2高表达与预后不良相关。此外，我们发现miR-31和BCL2表达之间存在负相关，强调了通过miR-31直接靶向PRKCE间接下调BCL2的功能相关性。

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图1。
图1。
miR-31的过表达通过一种不依赖于已知直接靶点RhoA和NF-κB诱导激酶的机制降低NF-κB活性(NIK公司; MAP3K14）。 一，通过NF-κB报告荧光素酶试验分析HEK293FT细胞中的NF-kb B活性。细胞与3xKBL荧光素酶报告质粒、pMir-Report-β-Gal报告质粒共转染以进行正常化和显示的MIRIDIAN miRNA模拟物。转染后48 h，用20 ng/ml TNF-α刺激细胞5 h，并量化相对荧光素酶活性(RLU（RLU），相对荧光素酶单位）。b条通过Western blot染色分析HEK293FT细胞中NF-κB活性的磷酸化p65（Ser-536）。用所示的miRNA模拟物转染细胞。转染后48 h，用20 ng/ml TNF-α刺激细胞15 min，制备蛋白裂解物。GAPDH被用作加载控制(控制). MCF10A中NF-κB活性(c)和MDA-MB-231(d日)采用NF-κB p65核转位分析法对细胞进行分析。用所示的miRNA模拟物转染细胞。转染后48小时，用20 ng/ml TNF-α刺激细胞15分钟，并对p65进行免疫染色。细胞核用DAPI染色，并用Olympus ScanR高含量筛选显微镜测定以核定位为主的p65“活性”细胞与以细胞质定位为主的“被动”细胞的比率。e（电子），通过qRT-PCR测定miRNA模拟物转染后miR-31的表达水平。（f），用NF-κB报告荧光素酶法分析HEK293FT细胞中NFκB的活性。细胞与3xKBL荧光素酶报告质粒、pMir-Report-β-Gal报告质粒共转染以进行正常化和指示的siRNA。转染后48 h，用20 ng/ml TNF-α刺激细胞5 h，并量化相对荧光素酶活性。
图2。
图2。
PRKCE是miR-31的直接靶点，具有三个结合位点。 一，的3′-UTR内miR-31靶位点的示意图PRKCE公司以及他们的场地保护。3′-UTR包含两个低保守性和一个高保守性（位置3，标记于紫色)miR-31的目标位点。用于3′-UTR报告荧光素酶分析以证明miR-31直接靶向的psiCHECK2结构如下部面板。b条，mRNA水平PRKCE公司miR-31在MCF10A和MDA-MB-231细胞中过度表达后，通过qRT-PCR进行定量。用指示的miRNA模拟物转染细胞（ctrl：对照）。转染后48小时，提取RNAPRKCE公司通过qRT-PCR定量表达。表达式被标准化为HPRT1型和GAPDH看家基因（siCtrl：非靶向siRNA控制）。cWestern blot分析miR-31在MCF10A和MDA-MB-231细胞过度表达后PRKCE的蛋白水平。用指示的miRNA模拟物或siRNA转染细胞。转染48小时后，制备蛋白裂解物，并进行蛋白激酶E染色的Western blot。肌动蛋白被用作负荷控制。日期：，荧光素酶报告子分析使用psiCHECK结构进行，如面板a(RLU、，相对荧光素酶单位）。
图3。
图3。
击倒PRKCE公司降低NF-κB活性。 一，通过NF-κB报告荧光素酶试验分析HEK293FT细胞中的NF-kb B活性。细胞与3xKBL荧光素酶报告质粒、pMir-Report-β-Gal报告质粒共转染以进行正常化和指示的siRNA。转染后48 h，用20 ng/ml TNF-α刺激细胞5 h，并量化相对荧光素酶活性。MCF10A中NF-κB活性(b条)和MDA-MB-231(c)采用NF-κB p65核转位分析法对细胞进行分析。用所示的miRNA模拟物转染细胞。转染后48小时，用20 ng/ml TNF-α刺激细胞15分钟，并对p65进行免疫染色。用DAPI染色细胞核，用Olympus ScanR高含量筛选显微镜测定以核定位为主的p65活性细胞与以细胞质定位为主的被动细胞的比率。d日，通过活性磷酸化p65（Ser-536）的蛋白质印迹染色分析HEK293FT、MCF10A和MDA-MB-231细胞中的NF-κB活性。用所示的miRNA模拟物转染细胞。转染后48 h，用20 ng/ml TNF-α刺激细胞15 min，制备蛋白裂解物。GAPDH被用作负荷控制。
图4。
图4。
miR-31通过减少PRKCE公司表达式。miRNA模拟物转染MCF10A和MDA-MB-231细胞的凋亡(一)通过NucView-488分析评估siRNAs(b条). 用指示的miRNA模拟物或siRNA转染细胞。转染后48h，凋亡细胞用NucView-488染色，所有细胞的细胞核用DAPI染色。使用Olympus ScanR高含量筛选显微镜采集板，使用ScanR分析软件自动计数NucView-488染色阳性的细胞核和细胞。miRNA模拟物转染MCF10A和MDA-MB-231细胞的放射敏感性(c)和siRNA(d日)照射72 h后通过Celltite-Glo细胞活性测定测定。绘制了用5格雷照射的细胞存活率与未照射细胞存活率的比值。miRNA模拟物转染MCF10A细胞的敏感性(e（电子）)和siRNA(（f）)治疗72h后用Celltite-Glo细胞活力测定法测定对staurosporine的抑制作用。浓度按log-10比例绘制，IC50值如下表所示。MCF10A的灵敏度(克)和MDA-MB-231(小时)将miRNA模拟物或siRNAs转染到嵌入化疗药物阿霉素的细胞在治疗72小时后通过Celtiter-Glo细胞活性测定测定。浓度按对数-10比例绘制。我NCI-60细胞系组中的乳腺癌和卵巢癌细胞系用于将miR-31的表达与阿霉素敏感性相关联。Ctrl键，控制。
图5。
图5。
间接下调BCL2级通过直接下调PRKCE公司说明miR-31过度表达后敏感性增强。 一，的信使核糖核酸水平BCL2级miR-31过度表达或敲除或PRKCE公司用qRT-PCR对MCF10A和MDA-MB-231细胞进行定量。用指示的miRNA模拟物或siRNA转染细胞。转染后48小时，提取RNABCL2级通过qRT-PCR定量表达。表达式被规范化为HPRT1型和GAPDH管家基因。Western blot显示在所示转染后MCF10A细胞中BCL2蛋白表达如下所示。b条，MCF10A和MDA-MB-231在敲低BCL2级通过NucView-488分析进行评估。用指示的miRNA模拟物或siRNA转染细胞。转染48 h后，用NucView-488对凋亡细胞进行染色，用DAPI对所有细胞的细胞核进行染色。使用Olympus ScanR高含量筛选显微镜采集板，使用ScanR分析软件自动计数NucView-488染色阳性的细胞核和细胞。同样，对staurosporine和阿霉素的敏感性(c)和基底细胞凋亡(d日)使用稳定过度表达BCL2或PRKCE的MCF10A细胞测定。蛋白质过度表达如下图所示d.电子用Celtiter-Glo细胞活性测定法测定辐照72 h后转染miRNA模拟物和siRNA的MCF10A和MDA-MB-231细胞的放射敏感性。绘制了用5格雷照射的细胞存活率与未照射细胞存活率的比值。（f）处理72小时后，用Celtiter-Glo细胞活力测定法测定转染有指示siRNAs的MCF10A细胞对staurosporine的敏感性。浓度按对数-10比例绘制。克、miR-31与BCL2级乳腺癌患者样本（GSE19783）中的表达，包括临床数据，均采用皮尔逊相关分析(第页= −0.22,第页= 0.03,n个= 99).小时，Kaplan-Meier图，分离高血糖患者（GSE19783）BCL2级低水平患者的表达BCL2级表达式(n个= 99,第页= 0.1).Ctrl键，控制。
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    1. Toft D.J.，Cryns V.L.（2011）《迷你评论：基底样乳腺癌：从分子特征到靶向治疗》。分子内分泌。25, 199–211-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Garg A.K.、Hortobagyi G.N.、Aggarwal B.、Sahin A.A.、Buchholz T.A.（2003）核因子-κB作为乳腺癌治疗反应的预测因子。货币。操作。昂科尔。15, 405–411-公共医学
    1. Perego P.、Corna E.、De Cesare M.、Gatti L.、Polizzi D.、Pratesi G.、Supino R.、Zunino F.（2001）蒽环类药物的细胞反应和抗肿瘤疗效中凋亡和凋亡相关基因的作用。货币。医药化学。8, 31–37-公共医学

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