Annexin A2 is a natural extrahepatic inhibitor of the PCSK9-induced LDL receptor degradation

doi:10.1371/journal.pone.0041865

.2012;7（7）：e41865。

doi:10.1371/journal.pone.0041865。 Epub 2012年7月27日。

Annexin A2是PCSK9诱导的低密度脂蛋白受体降解的天然肝外抑制剂

Nabil G Seidah公司¹, 史蒂夫·波里埃, 马克西姆·丹尼斯, 雷克斯·帕克, 鲍曼·缪, 克劳迪奥·马佩利, 安妮克·普拉特, 汉尼·沃瑟夫, 让·达维尼翁, 凯瑟琳·哈贾尔, 盖坦·梅耶

附属公司

PMID： 22848640
预防性维修识别码：项目经理3407131
内政部： 10.1371/日记本.0041865

Annexin A2是PCSK9诱导的低密度脂蛋白受体降解的天然肝外抑制剂

纳比尔·G·塞达等人。公共科学图书馆一号. 2012.

.2012;7（7）：e41865。

doi:10.1371/journal.pone.0041865。 Epub 2012年7月27日。

作者

纳比尔·G·塞达¹, 史蒂夫·波里埃, 马克西姆·丹尼斯, 雷克斯·帕克, 鲍曼·缪, 克劳迪奥·马佩利, 安妮克·普拉特, 汉尼·沃瑟夫, 让·达维尼翁, 凯瑟琳·哈贾尔, 盖坦·梅耶

附属

¹加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学附属蒙特利尔临床研究所生化神经内分泌实验室。

PMID： 22848640
预防性维修识别码：项目经理3407131
内政部： 10.1371/日志.pone.0041865

摘要

前蛋白转化酶枯草杆菌素/kexin-9（PCSK9）增强肝脏低密度脂蛋白受体（LDLR）的降解。人类PCSK9基因的缺失和功能丧失突变导致循环低密度脂蛋白胆固醇水平降低，并对冠心病有很强的保护作用。因此，寻求PCSK9抑制剂具有重要的临床意义。我们之前已经确定膜联蛋白A2（AnxA2）是PCSK9的内源性结合伙伴和功能抑制剂。在此，我们研究了AnxA2在体内抑制PCSK9和脂质代谢中的相关性。AnxA2（-/-）小鼠的血浆分析显示：i）低密度脂蛋白胆固醇增加了约1.4倍，VLDLs或HDL没有显著变化，ii）循环PCSK9水平增加了约2倍。AnxA2（-/-）组织的Western blotting和免疫组化显示，肝外组织（如肾上腺和结肠）中的LDLR降低了约50%。我们还表明，AnxA2衍生的合成肽在体外阻断了PCSK9≡LDLR相互作用，而小鼠肝脏中AnxA2的腺病毒过度表达增加了体内的LDLR蛋白水平。这些结果表明AnxA2是LDLR降解的内源性调节因子，主要在肝外组织中。最后，我们确定了AnxA2编码多态性V98L，该多态性与PCSK9的低循环水平相关，从而扩展了我们关于AnxA2在人类中生理作用的结果。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：作者阅读了该杂志的政策，并有以下冲突：NGS、SP、MD、HW、JD、AP是IRCM的员工。GM是MHI的员工。KAH是康奈尔大学的一名员工。RP、BM和CM是百时美施贵宝的员工。GM、SP、NGS和IRCM拥有Annexin A2及其衍生物抑制PCSK9的专利（#12/994835）。这不会改变作者对所有PLOS ONE政策的遵守，包括共享数据和材料。

数字

**图1。循环PCSK9增加*附录A2^−/−*老鼠。**
（A）野生型（WT）和*附录A2* ^−/−使用抗小鼠PCSK9（mPCSK9）多克隆抗体对小鼠进行免疫沉淀（IP），并使用材料和方法中描述的相同抗体通过Western blotting（WB）进行检测。在野生型和*AnxA2型* ^−/−老鼠。作为对照，使用相同的方法免疫沉淀血浆中的PCSK9PCSK9系列 ^−/−并导致条带缺失。作为负荷控制，在PCSK9免疫沉淀之前，使用兔抗鼠白蛋白通过Western blotting检测血浆白蛋白。（B）免疫沉淀血浆PCSK9的蛋白印迹如（A）所示，通过扫描密度测定法进行量化（n=7只WT小鼠血浆样品，n=8只*附录A2* ^−/−小鼠血浆样本）。（C） WT和*附录A2* ^−/−使用ELISA检测的小鼠（n=1件9 ^−/−，n=4重量，n=3AnxA2型 ^−/−小鼠血浆样本）。条形图和误差条形图表示平均值±标准偏差。P值通过双尾Student t检验获得。

**图2。肝外组织中LDLR水平降低*附录A2* ^−/−老鼠。**
（A–C）WT肾上腺（A）、回肠、结肠（B）和肝脏（C）的单个组织样本或组织池中LDLR和AnxA2的蛋白质印迹*附录A2* ^−/−老鼠。为LDLR获得的WB信号的扫描密度测定量化显示在A–C的右侧面板上。LDLR相对强度根据β-actin获得的信号进行归一化。对于每个基因型，显示了用于量化的动物数量（每组5–8只）。条形图和误差条形图表示平均值±标准偏差。P值通过双尾Student t检验获得。

**图3。WT组织中LDLR和AnxA2的免疫荧光染色*附录A2* ^−/−老鼠。**
固定冷冻肾上腺、回肠或肝组织切片，并用抗AnxA2（A）或抗LDLR（B）抗体孵育。结合的一级抗体与物种特异性Alexa-488（绿色）二级抗体一起被发现。细胞核用蓝色荧光DNA染料DAPI进行复染。（A）左图中的箭头显示AnxA2沿肾上腺皮质毛细血管（顶图）、回肠吸收细胞基底外侧膜（中图）和WT小鼠肝窦毛细血管（底图）的定位。AnxA2组织中缺乏AnxA2标记^−/−小鼠（右图）证明了抗体的特异性。（B）左图中的箭头描绘了LDLR在肾上腺皮质细胞的细胞表面（上图）、回肠中吸收细胞的基底外侧膜和顶面（箭头）以及WT小鼠的肝细胞面对窦的基底外侧表面（下图）的定位。相应的LDLR染色*附录A2^−/−*小鼠肾上腺和回肠的组织明显减少，而肝脏的组织变化较小（右图）。

**图4。AnxA2 R1结构域的肽干扰PCSK9≡LDLR相互作用。**
混合His-tagged LDLR外结构域（15 nM）和生物素化PCSK9（15 nM），并在20°C下在AnxA2肽浓度增加的情况下培养60分钟。将链霉亲和素供体珠和镍螯合物受体珠添加到分析混合物中，并在20°C下培养过夜。在580 nm发射波长下测量AlphaScreen发光信号。发光信号的降低揭示了AnxA2肽与PCSK9 lect LDLR相互作用的竞争，并证明最长的AnxA2肽（aa 25–97）通过IC抑制PCSK9与LDLR的结合₅₀0.6µM。⁷⁷AATAA是指⁷⁷ 右后T型KK公司 ⁸¹.

**图5。在小鼠肝脏中腺病毒过度表达AnxA2显著增加LDLR水平。**
将空白对照（Ad-Ctl）和HA标记的AnxA2（Ad-A2）腺病毒静脉注射到WT（A）或*件9^−/−*（B）老鼠。7天后，通过Western blotting分析肝脏的LDLR水平和AnxA2-HA表达。条形图和误差条形图表示平均值±标准偏差。P值通过双尾Student t检验获得。（C） WT肝脏中LDLR和AnxA2-HA的免疫组织化学*件9^−/−*（下面板）注射Ad-Ctl或Ad-A2腺病毒的小鼠。固定冷冻肝组织切片，并与抗LDLR和抗HA抗体孵育。结合一级抗体与物种特异性Alexa-488（LDLR，绿色）和Alexa-555（HA，红色）二级抗体结合。细胞核用DAPI（蓝色）复染。箭头显示LDLR与AnxA2-HA在肝细胞表面共定位。棒材=20µm。

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1. Cenarro A、Garcia-Otin AL、Tejedor MT、Solanas M、Jarauta E等。一个推测的常染色体显性高胆固醇血症新基因座，映射到8q24.22。临床遗传学。2011;79:475–481.-公共医学
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