跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2012年5月13日；14(6):593-603.
doi:10.1038/ncb2489。

Hec1环域招募人类Cdt1复制许可蛋白是稳定动粒微管附着所必需的

迪利普·瓦尔马 1, Srikripa Chandrasekaran公司, 林西·J·R·桑丹, 凯伦·特雷迪, 小虎丸, 黎明A D追逐, 凯萨琳·R·尼维斯, 詹妮弗·德卢卡, E D三文鱼, 珍妮特·戈文（Jeanette Gowen Cook）
附属公司

Hec1环域招募人类Cdt1复制许可蛋白是稳定动粒微管附着所必需的

迪利普·瓦尔马等。 Nat细胞生物学. .

摘要

Cdt1是G1期复制起源许可的关键蛋白，在S期降解，但在G2期重新累积。我们现在证明了人类Cdt1具有可分离的基本有丝分裂功能。Cdt1通过与Ndc80复合体Hec1组分的相互作用在有丝分裂期间定位于动粒。由于动粒细胞微管（kMT）附着异常不稳定和Mad1依赖性纺锤体组装检查点活性，G2特异性Cdt1耗竭可使细胞停滞在前中期晚期。Cdt1绑定从Hec1的杆域延伸的唯一环，我们证明这也是kMT连接所必需的。环结构域的突变阻止了Cdt1动粒定位并使细胞停滞在前中期。超分辨荧光显微镜显示，Cdt1与Hec1环结构域的结合促进了体内Ndc80复合体中微管相关的构象变化。这些结果支持这样的结论，即Cdt1与Hec1的结合对于Ndc80的扩展构型和稳定的kMT连接至关重要。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。S期后Cdt1耗尽的细胞不能完成细胞分裂
（a）)用靶向siRNAs转染正常人成纤维细胞（NHF1-htert）cdc6型,cdt1或GFP（对照）mRNA 72小时。最后一小时用BrdU标记细胞，然后通过流式细胞仪分析细胞周期位置，并通过免疫印迹法分析内源性Cdc6、Cdt1和Tubulin。(b)实验设计图。内源性Cdt1蛋白水平通常在S期由于泛素介导的蛋白水解而下降，并在G2期开始恢复（灰色虚线）。从早期的S块释放到cdt1siRNA转染培养基阻断Cdt1蛋白的再积累（实线灰色）。(c（c）)同步化细胞内源性Cdt1蛋白的免疫印迹分析b; M期发生在第二次胸苷停搏释放后9至10小时。(d日)用空载体（1-4道）或抗siRNA形式的Cdt1（“Cdt1”）转导的稳定HeLa细胞系物件“车道5和6）与b并转染以GFP为靶点的对照siRNA（通道1和2）或cdt1siRNA（3-6通道）。将细胞从早期S期释放到诺卡唑中10小时，然后收获（0小时）或释放2小时进入G1期，并通过免疫印迹分析Cdt1蛋白水平。(e（电子）)流式细胞术分析d日.
图2
图2。G2特异性Cdt1抑制诱导有丝分裂阻滞
(一)同步于早期S期的HeLa细胞被释放到对照组（荧光素酶）或cdt1siRNA 9小时（上图和中图）或10小时（下图），然后用DAPI固定和染色以标记染色体（蓝色），用抗微管蛋白抗体标记MT（红色），用抗Knl1抗体标记动粒（绿色）。(b)10小时后结果的量化一有丝分裂期；n=1500个单元。(c–e类)将稳定表达GFP-组蛋白H2B的HeLa细胞注入对照缓冲液(c、，n=15）或抗Cdt1抗体(日期：，n=27）。显示了GFP-组蛋白的选定帧（顶部面板）和相位对比图像（底部面板）。(e（电子）)微量注射实验结果的量化c（c）和d日.比例尺=5μm。另请参阅补充电影S1–S4。
图3
图3。Cdt1在前中期和中期短暂定位于动粒
(一)用抗Cdt1抗体和抗Hec1抗体对诺卡唑处理的PTK2细胞进行免疫染色。(b–f)用抗Cdt1抗体和抗Hec1抗体对有丝分裂不同阶段的LLCPK1细胞进行免疫染色。比例尺=5μm。
图4
图4。Cdt1动粒定位需要Hec1
(一)将T98G（人类胶质母细胞瘤）细胞的裂解液与涂有细菌产生的GST或GST-Cdt1的珠培养，通过免疫印迹法在输入或结合组分中检测内源性Hec1和Nuf2。(b)HeLa细胞的全细胞裂解物与免疫前血清或抗Cdt1抗体孵育，在输入和免疫复合物中检测到内源性Hec1。（ND:Cdt1与IgG重链共迁移过近，无法在该IP中进行检测。）(c（c）)HeLa细胞的全细胞裂解物与对照血清或抗Hec1抗体孵育；在输入和免疫复合物中检测到内源性Cdt1和Hec1。(d日)Nocodazole处理的PTK2细胞hec1型RNAi被固定并用抗Cdt1抗体和抗ACA抗体染色以标记动粒。(e（电子）)Cdt1动粒荧光强度的定量d日相对于对照荧光素酶siRNA转染的细胞；n=80个动粒；p<0.01。(如果)用对照荧光素酶siRNA或hec1型siRNA，用抗Orc6抗体固定并染色，用抗Hec1抗体监测Hec1敲除，用抗ACA抗体标记动粒。(克)Orc6动粒荧光强度的定量如果相对于对照荧光素酶siRNA转染细胞；n=125个动粒；p<0.01。比例尺=5μm。
图5
图5。Cdt1靶向动粒取决于Hec1的柔性环区域
(一)Ndc80复合体图，显示环区和Hec1环替换突变体“Hec1 loop”的构建MUT（多用途）”，（改编自Ciferri等人，2008）。(b)从转染Hec1-GFP质粒的异步生长HeLa细胞的裂解液中免疫沉淀内源性Cdt1；“Ctrl-IP”表示使用正常小鼠血清作为对照。用抗GFP抗体检测结合（“Cdt1 IP”）和未结合（“Supe”）组分中的Hec1-GFP。(c（c）)PTK2细胞用hec1型siRNA随后转染重量Hec1-GFP或Hec1回路MUT公司-GFP构造。用诺卡唑处理细胞，然后用抗Cdt1抗体和抗GFP抗体固定和染色。(d日)如中所示c（c）但HeLa细胞被抗Orc6和抗GFP抗体染色。(e（电子）)如中所示c（c）除HeLa细胞用抗微管蛋白抗体标记MT外，抗GFP抗体在动粒标记Hec1-GFP。(如果)异位表达Hec1缺失细胞有丝分裂期的定量重量Hec1 GFP或Hec1环MUT公司-GFP DAPI染色；n=125个GFP表达细胞。比例尺=5μm。另请参见补充图S8和补充电影S5和S6。
图6
图6。Cdt1和Hec1环域需要满足spindleassembly检查点
(a）顶部和中间面板：Cdt1耗尽或控制电池，如图2所示b（胸腺嘧啶释放后10小时）。底部面板：Hec1缺失细胞表达siRNA-resistant Hec1 LoopMUT公司–GFP。细胞被固定并用Mad1抗体染色以评估纺锤体组装检查点活性，用Knl1标记动粒。(b)有丝分裂细胞中Mad1动粒水平的量化cdt1小干扰RNA；n=125个动粒；p<0.01。(c（c）)表达Hec1的有丝分裂细胞中Mad1水平的定量重量或循环MUT公司构建而非内源性Hec1；n=150个动粒；p<0.01。(d–g)用对照荧光素酶siRNA转染双胸腺嘧啶同步化HeLa细胞(d日),cdt1小干扰RNA(e（电子）),mad1型小干扰RNA(如果)以及两者的结合cdt1和mad1型小干扰RNA(克)S相释放后9小时或10小时用DAPI（伪红色）和抗微管蛋白抗体（绿色）染色。
图7
图7。稳定的kMT附件需要Cdt1和Hec1环域
(一)中期对照细胞、Cdt1缺失细胞和表达Hec1环的细胞MUT公司（代替内源性Hec1）与冰冷的PBS（其仅允许保留稳定的kMT）一起孵育，然后用抗微管蛋白抗体（MT）和抗Bub1抗体固定和染色以标记动粒，或用抗GFP抗体标记异位Hec1。(b)量化Cdt1耗尽或Hec1环中与K纤维成功接触的动粒比例MUT公司细胞；n=250个动粒(c（c）)指示细胞中的动粒间距离（K-K）；n=100–125个动粒；p<0.01。(d日)用对照荧光素酶或cdt1如图所示，在S期释放后8.5小时，用ZM447439（Aurora B抑制剂）和MG132（后期抑制剂）处理siRNA一小时，然后进行冷处理，并用抗微管蛋白抗体和抗Knl1抗体染色。(e（电子）)同步化HeLa细胞与hec1型siRNA和编码不可磷酸化9A-Hec1-GFP的质粒（顶面板），然后在S相释放后8.5小时进行MG132处理小时，或编码Hec1-Loop的质粒MUT公司-GFP（底部面板）。然后在S期释放后9小时对细胞进行冷处理，并用抗微管蛋白抗体和抗GFP抗体进行染色。比例尺=5μm。
图8
图8。正确的Ndc80构象需要Cdt1和Hec1环域体内
(一)描述用于Delta分析的抗体表位的Ndc80复合物图。(b)用Hec1 CH结构域和Spc24头部结构域抗体标记的正常有丝分裂中期细胞的代表性图像。比例尺=1μm。(c（c）)同步对照细胞或Cdt1缺失的有丝分裂细胞（S期释放后9小时）或Rod-deplete细胞（从非同步群体中选择的有丝细胞中期细胞）中Spc24和Hec1 CH结构域（9G3抗体）之间平均分离的δ值（倾斜校正）；n=84、47和54个动粒对；（控制与。硅-cdt1)p<0.001（对照组与。硅-杆)p=0.31（不显著）。(d日). 如中所示c（c）除了测定了Nsl1（Mis12复合亚基）和Hec1 CH结构域之间的分离δ值外；n=74、41和60个动粒对；（控制与。硅-cdt1)p<0.001（对照组与。硅-杆)p=0.86（不显著）。(e（电子）)Cdt1-Hec1环域相互作用的比例模型。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

中的注释

  • Cdt1将动粒-微管附件抛入循环。
    Matson DR，Stukenberg PT公司。 Matson DR等人。 自然细胞生物学。2012年5月30日；14(6):561-3. doi:10.1038/ncb2513。 自然细胞生物学。2012 PMID：22643874 免费PMC文章。

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. DeLuca JG等。动粒微管动力学和附着稳定性受Hec1调节。单元格。2006;127:969–982.-公共医学
    1. Cheeseman IM、Chappie JS、Wilson-Kubalek EM、Desai A.保守的KMN网络构成动粒的核心微管结合位点。单元格。2006;127:983–997.-公共医学
    1. Alushin GM等。Ndc80动粒复合体沿微管形成寡聚物阵列。自然。2010;467:805–810。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Hsu-KS，Toda T.Ndc80内环与Dis1/TOG相互作用，以确保分裂酵母中的动粒纺锤体正确附着。当代生物学。2011;21:214–220.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Maure JF等。Ndc80环区有助于动粒附着到动态微管正末端的形成。当代生物学。2011;21:207–213.-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型