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.2011年9月30日8:126。
doi:10.1186/1742-2094-8-126。

炎症性疼痛中背根神经节BDNF和trkB受体上调的体内外研究

林雅婷 1, 龙胜Ro, 王洪力, 陈金昌
附属机构

炎症性疼痛中背根神经节BDNF和trkB受体上调的体内外研究

林雅婷等。 J神经炎症. .

摘要

背景：炎症期间，免疫细胞在受损区域积聚，并释放促炎细胞因子和神经营养素。脑源性神经营养因子（BDNF）通过突触后酪氨酸蛋白激酶B（trkB）受体在脊髓背角发挥神经调节作用，促进疼痛传递。然而，炎症期间BDNF和trkB受体在背根神经节（DRG）初级感觉神经元中的确切作用尚待阐明。本研究的目的是研究DRG中BDNF-trkB信号是否以及如何参与炎症疼痛过程。

方法：我们使用完全弗氏佐剂（CFA-）诱导和肿瘤坏死因子-α-（TNF-α-）诱导的大鼠后足炎症作为炎性疼痛的动物模型。在单独的腰椎L3-L5 DRG中对疼痛介质的蛋白质和/或mRNA水平进行量化。在收集自混合L1-L6 DRG的原始DRG培养物中，研究了TNF-α诱导BDNF和/或trkB受体表达的细胞机制。酶免疫法检测降钙素基因相关肽（CGRP）、BDNF和P物质释放。

结果：将CFA注射到大鼠后足导致机械性痛觉过敏，炎症组织中TNF-α水平显著升高，同时BDNF和trkB受体以及DRG中的疼痛介质CGRP和瞬时受体电位香草醛受体亚型1（TRPV1）增强。在CFA诱导的炎症过程中，向大鼠后肢直接注射TNF-α可引起类似的效应，即TNF-β沿隐神经逆行转运至DRG。用TNF-α长期处理的原代DRG培养物显示，BDNF和trkB受体的mRNA和蛋白水平、BDNF释放和trkB-诱导的磷酸化ERK1/2信号显著增强。此外，慢性TNF-α治疗或急性BDNF刺激后，DRG培养物中CGRP和P物质的释放增强。此外，我们发现BDNF上调了DRG培养物中trkB的表达。

结论：根据我们目前的实验结果，我们得出结论，炎症和TNF-α上调了DRG的BDNF-trkB系统。这一现象表明，DRG中BDNF的上调除了在脊髓背角产生突触后效应外，还可能作为一种自分泌和/或旁分泌信号激活突触前trkB受体，调节疼痛传递中的突触兴奋性，从而促进痛觉过敏的发展。

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数字

图1
图1
大鼠后爪和冯·弗雷植物内注射CFA或TNF-α后的痛觉过敏试验在SD大鼠右后足注射CFA、TNF-α或生理盐水（对照）72小时后，我们观察了后足（A-C）。每天进行为期三天的痛觉过敏测试（D，E）。生理盐水：0.9%氯化钠（同侧）注射。对照组（对侧）：对侧CFA或TNF-α。CFA（ipsi）：注射CFA（100μl）。TNF-α（ipsi）：注射500 ng TNF-β（30μl）。使用单因素方差分析和Tukey检验对数据进行分析，并用平均值±SEM表示**第页< 0.01, ***第页< 0.001; 与基础组相比（SD大鼠，CFA注射组N=5，TNF-α注射组N=3）。
图2
图2
植物内注射CFA后后足中TNF-α的水平.注射CFA 72小时后，立即收集双侧后肢组织并用TNF-αEIA试剂盒进行分析。对照（对侧）：对侧CFA，无注射。CFA（ipsi）：注入。数据表示为平均值±SEM，并使用未配对学生的t吨-测试***第页< 0.001; 与对照组（SD大鼠，每组N=7只）相比。
图3
图3
植物内注射CFA后DRG中TRPV1、trkB、BDNF和CGRP的表达注射CFA 72小时后，检测L3-L5 DRG中TRPV1、trkB、BDNF和CGRP的mRNA和蛋白水平。（A） 用实时PCR检测mRNA水平。值被标准化为18S值，并以相应对照的百分比表示。数据表示为平均值±SEM，并由未配对学生的t吨-测试*第页< 0.05; 与相应的对照组相比（每组N=3~6，共12只大鼠）。（B） DRG切片中trkB、BDNF和CGRP免疫反应的定量测定。用标准免疫组织化学ABC法检测蛋白质水平。数据以L3-L5 DRG中免疫阳性神经元的百分比表示。（C-H）显微照片显示了L3 DRG切片中trkB、BDNF和CGRP的免疫反应性。（C-E），对照组；（F-H），CFA组。比例尺，50μm。数据表示为平均值±SEM，并使用未配对学生的t吨-测试*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001; 与相应的对照组相比（对侧注射CFA）。N=每组9人。对照，ctr（contra）：对侧CFA，非注射。CFA（ipsi）：注入。
图4
图4
植物内注射TNF-α后DRG中trkB、BDNF和CGRP蛋白的含量注射TNF-α（每天两次，连续三天）后，在L3-L5 DRG中测量trkB、BDNF和CGRP的水平。用标准免疫组织化学ABC法检测蛋白表达。（A） DRG切片中trkB、BDNF和CGRP免疫反应的定量测定。数据以L3-L5 DRG中免疫阳性神经元的百分比表示。（B-G）显微照片显示L4 DRG切片中trkB、BDNF和CGRP的免疫反应性。（B-D），对照组；（E-G）、TNF-α组。比例尺，50μm。对照，ctr（contra）：对侧TNF-α。TNF-α（ipsi）：注射。数据表示为平均值±SEM，并使用未配对学生的t吨-测试*第页< 0.05, **第页< 0.01; 与相应的对照组相比（注射TNF-α的对侧）。N=每组9人。
图5
图5
BDNF和TNFR1在L3-L5 DRG中的共同定位用双重免疫荧光染色法检测免疫反应性。注射CFA 72小时后收集L3-L5 DRG。BDNF以绿色荧光显示，TNFR1以红色荧光显示。（A） 条形图表示显示TNFR1和BDNF共同定位的细胞数量的定量测量。数据表示为平均值±SEM，并使用未配对学生的吨-测试***第页<0.001（每组9个）；与对照组相比。（B-D）显微照片显示对照组L3 DRG切片中BDNF（B）和TNFR1（C）的免疫反应性。（D） 合并了（B）和（C）的图像。（E-G）显微照片显示CFA组L3 DRG切片中BDNF（E）和TNFR1（F）的免疫反应性。（G） （E）和（F）的合并图像。插入物显示了共同定位在DRG神经元中的BDNF和TNFR1信号。宽箭头，共同本地化BDNF和TNFR1；窄箭头，TNFR1；箭头，BDNF。比例尺，50μm。
图6
图6
TNF-α治疗后DRG培养物中TRPV1、trkB、BDNF和CGRP的表达量（A）DRG培养物中TRPV1、trkB、BDNF和CGRP mRNA的水平（每组N=3-7）。在5nM TNF-α处理6至48小时后，通过实时PCR评估mRNA表达水平，并将结果标准化为18S值。数据以平均值±SEM表示，以基础（无药物治疗）的百分比表示，并使用单因素方差分析和Tukey检验进行分析*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001; 与相应的基础组相比。（B-J）显微照片显示了DRG培养物中BDNF、trkB和CGRP的免疫反应性。在DRG培养物中用5 nM TNF-α处理24或48小时后，用免疫荧光染色或免疫组织化学ABC法检测蛋白量。（B，E，H）基础蛋白表达（无药物治疗）。（C，F，I）TNF-α治疗24小时。（D，G，J）TNF-α治疗48小时。比例尺，50μm。
图7
图7
TNF-α诱导的DRG培养物中BDNF的含量和释放在5 nM TNF-α处理24和48小时后，收集培养基和裂解细胞，并通过BDNF EIA进行分析。BDNF释放代表培养基中的基础或TNF-α诱导的BDNF；BDNF含量是指培养的DRG细胞中残留的基础或TNF-α诱导的BDNF。数据以平均值±SEM表示，并使用单因素方差分析和Tukey检验进行分析*第页< 0.05; 与相应的基础组相比（每组5个）。
图8
图8
NGF或BDNF处理后DRG培养物中TRPV1、BDNF、trkB和CGRP mRNA的表达（A）100 ng/ml NGF治疗后TRPV1、BDNF、trkB和CGRP mRNA表达，每天一次，持续24-96小时。（B） 100 ng/ml BDNF处理后TRPV1、trkB和CGRP mRNA表达，每天一次，持续24-72小时。数据表示为平均值±SEM，表示为基础（无药物治疗）水平的百分比，并使用单向AVOVA和Tukey试验进行分析*第页< 0.05, **第页< 0.01; 与相应的基础组相比（每组N=5~8）。
图9
图9
BDNF诱导的磷酸化ERK信号及TNF-α处理后磷酸化ERK-和TNFR1在DRG培养物中的共定位5 nM TNF-α预处理48小时后，400 ng/ml BDNF预处理0-40分钟后，检测到磷酸ERK信号。通过双重免疫荧光染色检测磷酸ERK和TNFR1蛋白。（A） DRG培养物中磷酸-ERK荧光强度的定量测量。数据以免疫阳性神经元的荧光强度表示，表示为平均值±SEM，并使用单向方差分析和Tukey检验进行分析**第页< 0.01; 与相应控制相比；#第页< 0.05,###第页< 0.001; TNF-α和时间匹配对照组之间的比较（每组9个）。（B-G）TNF-α治疗48小时后，在培养的DRG神经元中用BDNF急性治疗10分钟。磷酸ERK以绿色荧光显示，TNFR1以红色荧光显示。（B-D）显微照片显示了对照组DRG培养物中磷酸化ERK（B）和TNFR1（C）的免疫反应性（无TNF-α预处理）。（D） 合并了（B）和（C）的图像。（E-G）显微照片显示TNF-α组DRG培养物中磷酸化ERK（E）和TNFR1（F）的免疫反应性。（G） （E）和（F）的合并图像。插入物说明了磷酸化ERK和TNFR1信号在DRG神经元中共同定位。宽箭头，共定位磷酸化-ERK和TNFR1；窄箭头，TNFR1；箭头，磷化-ERK。比例尺，50μm。
图10
图10
TNF-α治疗后DRG培养物中BDNF诱导的磷酸化ERK免疫组织化学信号在5 nM TNF-α预处理48小时，然后400 ng/ml BDNF预处理0-40分钟后，检测到磷酸ERK信号。通过双重免疫荧光染色检测磷酸ERK和TNFR1蛋白。显微照片显示了对照组（无TNF-α预处理）（A）和TNF-A组（B）中单个磷酸化ERK和TNFR1或合并磷酸化ERK/TNFR1的蛋白质信号。比例尺，50μm。
图11
图11
TNF-α处理后BDNF在DRG培养物中诱导的磷酸化ERK1/2在400ng/ml BDNF之前，用5nM TNF-α处理DRG培养物48小时。BDNF治疗后40分钟，用免疫印迹法检测蛋白信号。（A，B）凝胶图片，分别显示对照组（无药物治疗）和TNF-α治疗组的磷酸化ERK1/2和β-肌动蛋白信号。（C，D）分别定量测量对照组和TNF-α治疗组的磷酸-ERK1和磷酸-ERK2信号。结果显示为与β-肌动蛋白的比值。数据表示为平均值±SEM，并使用单向方差分析和Tukey检验进行分析*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001; 与时间0相比。使用未配对学生的吨-测试；##第页< 0.01,###第页<0.001，（每组N=6）。
图12
图12
急性BDNF治疗TNF-α后细胞凋亡分析用5 nM TNF-α预处理DRG培养物48小时，然后用400 ng/ml BDNF预处理10或40分钟。立即固定细胞，用TUNEL反应试剂盒检测凋亡细胞。（A） 对照组；（B） TNF-α预处理组。DNase I处理的细胞作为阳性对照，而反应酶去除作为阴性对照。TUNEL染色用荧光绿染料检测，细胞用DAPI复染。插入物显示阳性对照的凋亡细胞。比例尺，50μm。
图13
图13
DRG培养物中基础和药物诱发的CGRP和P物质释放在5 nM TNF-α处理48小时后，添加400 ng/ml BDNF 30或60分钟。收集上清液并进行CGRP和P物质EIA分析。数据表示为平均值±SEM，表示为对照百分比。采用单向AVOVA和Tukey试验分析BDNF治疗的数据*第页<0.05时***第页< 0.001; 比较相应的基础组。使用未配对学生的t吨-测试，##第页< 0.01,###第页<0.001（每组N=5~7）。
图14
图14
DRG中TNF-α和TNFR1表达的逆行转运（A）在注射CFA（48小时）后，将TNF-α（标记有Alexa Fluor 488）注射到大鼠后肢，并以游离Alexa Furo 488作为对照。24小时后，分离隐神经，并用荧光显微镜检测荧光信号。显微照片显示了三个不同的节段：远端、中部和近端。比例尺，50μm。插入物显示了标有Alexa Fluor 488的放大轴突纤维，刻度条为20μm。（B-C）显微照片显示通过免疫荧光染色检测到的TNFR1免疫反应性。（B） 注射CFA 72小时后，收集L3-L5 DRG。（C） 在DRG培养基中TNF-α治疗48小时。比例尺，50μm。条形图表示TNFR1荧光强度的定量测量。数据以免疫阳性神经元的荧光强度表示，以平均值±SEM表示，并使用未配对的学生吨-测试**第页<0.01（每组N=3）；与对照组相比。
图15
图15
TNF-α介导炎症和痛觉过敏时DRG中BDNF-trkB上调的工作模型炎症时，TNF-α可能在与TNFR1结合的伤害感受器附近释放，并通过TNFR1逆行转运至DRG。在DRG中，TNF-α通过转录或翻译调节增强BDNF、trkB、CGRP和TRPV1的表达。增强的BDNF被局部释放，作为DRG突触前trkB受体的自分泌或旁分泌信号。因此，激活的trkB受体增加疼痛介质、CGRP和/或P物质的释放，并促进疼痛传播，可能通过磷酸化ERK1/2。
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