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.2011年3月1日；186(5):3173-9.
doi:10.4049/jimmunol.1003626。 Epub 2011年1月21日。

NF-κB-和AP-1介导的DNA环路调节内毒素刺激小鼠巨噬细胞中骨桥蛋白的转录

魏昭 1, 王丽娟, 孟张（Meng Zhang）, 王鹏（音译）, 张磊（Lei Zhang）, 朝元, 建尼奇, 于乔, 保罗·库奥, 澄江高
附属公司

NF-κB-和AP-1介导的DNA环路调节内毒素刺激小鼠巨噬细胞中骨桥蛋白的转录

魏昭等。 免疫学杂志. .

摘要

骨桥蛋白（OPN）由各种免疫细胞表达，调节先天性和适应性免疫反应。然而，控制opn基因表达的分子机制，特别是在染色质水平上，在很大程度上仍然未知。我们之前已经证明了许多特异的顺式和反式调节元件，它们决定了内毒素（LPS）介导的小鼠巨噬细胞OPN合成的诱导程度。在本研究中，我们证实NF-κB通过与远端调控元件结合，在LPS刺激的OPN表达的设置中也起着重要作用。重要的是，我们利用染色体构象捕获技术证明LPS刺激OPN启动子中NF-κB结合位点和AP-1结合位点之间的染色体环。NF-κB和AP-1在LPS刺激的DNA环化中的关键作用已得到证实，因为NFκB p65和AP-1 c-Jun的小干扰RNA敲除显示DNA环化水平降低。此外，我们证明p300可以与NF-κB和AP-1形成复合物，并参与DNA环和LPS诱导的OPN表达。因此，我们确定了一种重要的机制来重塑局部染色质结构和空间构象，以调节LPS诱导的OPN表达。

PubMed免责声明

利益冲突声明

披露

作者没有经济利益冲突。

数字

图1
图1
NF-κB参与LPS诱导的OPN表达。A类和B，RAW264.7巨噬细胞用DMSO或30µM JSH-23预处理40分钟，然后用100 ng/ml LPS刺激指定时间。分别用定量PCR和Western blot检测OPN mRNA和蛋白水平。C类用对照小RNA（Ctrl-siRNA）或p65 siRNA转染RAW264.7巨噬细胞。36 h后，用Western blot检测细胞中p65的表达。D类和电子用Ctrl-siRNA或p65 siRNA转染RAW264.7宏噬菌体，然后用100 ng/ml LPS处理指定时间。分别用定量PCR和Western blot检测OPN的表达水平。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。数据显示为平均值±SD(n个=3）一个代表性实验**第页< 0.01.
图2
图2
NF-κB与OPN启动子结合。A类，用OPN-1916、OPN-1916ΔNF-κB或pGL3碱性质粒转染RAW264.7巨噬细胞。培养24 h后，用100 ng/ml LPS刺激细胞6 h。细胞裂解物测定荧光素酶活性。以pGL3载体活性为1计算相对萤光素酶活性。显示了受刺激活动与未受刺激活动的比率。B类，RAW264.7巨噬细胞转染OPN-1916、OPN-1916-ΔNF-κB或pGL3碱性质粒。用DMSO或30µM JSH-23预处理细胞40 min，然后用100 ng/ml LPS刺激6 h。对细胞裂解物进行荧光素酶活性分析。以pGL3载体活性为1计算相对荧光素酶活性。显示了受刺激活动与未受刺激活动的比率。C类用100 ng/ml LPS或载体（水）刺激RAW264.7巨噬细胞达指定时间，并使用ChIP分析评估p65与小鼠OPN启动子−1926至−1759区域内NF-κB结合位点的结合。以总提取物作为负荷对照，以不相关抗体（抗肌动蛋白）免疫沉淀作为阴性对照。将小鼠OPN启动子−309至−136内NF-κB无位点区域扩增的PCR产物用作特异性对照。在三个独立的实验中也得到了类似的结果**第页< 0.01,▲ 第页> 0.05.
图3
图3
AP-1和NF-κB介导OPN启动子中的DNA环：3C分析。A、 RAW264.7巨噬细胞转染对照siRNA（Ctrl-siRNA）、c-Jun siRNA、p65 siRNA或p65 siRNA+c-Jun siRNA，然后用100 ng/ml LPS处理指定的时间段。Western blot检测OPN的表达水平。B类用100 ng/ml LPS刺激RAW264.7宏噬菌体0、30和60 min，在OPN位点进行PstI限制的3C分析。输入代表使用OPN保守AP-1结合位点特异引物的PCR产物，该引物用于确定样本中存在等量的模板DNA。C类用Ctrl-siRNA或c-Jun siRNA或c-Fos siRNA转染RAW264.7巨噬细胞。36 h后，用Western blot检测细胞中c-Jun或c-Fos的表达。D类RAW264.7巨噬细胞转染p65、c-Jun、c-Fos或对照siRNA的siRNA，然后用LPS刺激。3C检测采用OPN的PstI限制。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。
图4
图4
P300参与OPN表达和DNA循环。A类和B类RAW264.7巨噬细胞用DMSO或1µM TSA预处理40分钟，然后用100 ng/ml LPS刺激指定的时间段。分别用定量PCR和Western blot检测OPN mRNA和蛋白水平。C类和D类，RAW264.7巨噬细胞转染p300（mt），一个含有乙酰转移酶缺失的p300，或p300（wt）。培养24小时后，用100 ng/ml LPS刺激细胞，持续指定的时间。分别用定量PCR和Western blot检测OPN的表达水平。电子，RAW264.7巨噬细胞转染p300（mt）或p300（wt）。培养24h后，用LPS刺激细胞。使用引物A和C对OPN启动子进行3C分析。在三个独立的实验中获得了类似的结果。数据显示为平均值±SD(n个=3）一个代表性实验**第页< 0.01.
图5
图5
NF-κB、AP-1和p300共同占据OPN启动子。A类和B类用100 ng/ml LPS或载体（水）刺激RAW264.7巨噬细胞一段指定的时间，使用ChIP分析评估p65、c-Jun、c-Fos和p300与−1926至−1759区域内的NF-κB结合位点和小鼠OPN启动子−127至+42区域内的AP-1结合位点的结合。以总提取物作为负荷对照，以不相关抗体（抗肌动蛋白）免疫沉淀作为阴性对照。将小鼠OPN启动子−309至−136内NF-κB或AP-1无位点区域扩增的PCR产物用作特异性对照。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。
图6
图6
提出的模型说明了NF-κB和AP-1如何协同调节LPS诱导的OPN表达。在未激活的巨噬细胞中，没有NF-κB和AP-1与OPN启动子结合。LPS刺激后，NF-κB和AP-1结合到各自的顺式-招募动作序列和p300。这导致OPN启动子中DNA环的形成和随后的OPN表达。提示了小鼠OPN启动子中的NF-κB和AP-1位点。黑色垂直箭头表示PstI限制站点。黑色水平箭头表示用于3C分析的3C引物。空的垂直箭头表示报告质粒OPN-1916中构建的片段。TSS，转录起始位点。
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