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.2010年11月4日5:47。
doi:10.1186/1750-1326-5-47。

基因转移模型中帕金森相关帕金森降低α-突触核蛋白磷酸化

Preeti J Khandelwal公司 1, 索尼娅·B·杜马尼, 李丽贝卡·冯, 凯瑟琳·马奎里·泽斯（Kathleen Maguire-Zeiss）, Gw Rebeck公司, Hilal A Lashuel公司, 夏贝尔·艾·穆萨
附属公司

基因转移模型中帕金森相关帕金森降低α-突触核蛋白磷酸化

普雷蒂·J·坎德瓦尔等。 摩尔神经变性剂. .

摘要

背景：α-突触核蛋白聚集在路易小体中，并在一组神经退行性疾病（称为“突触核细胞病”，包括帕金森氏病）的发病机制中发挥中心作用。Parkin突变导致Parkin E3-泛素连接酶活性丧失，并导致常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征。

结果：我们通过检测帕金对基因转移动物模型中α-突触核蛋白翻译后修饰的影响来测试这两个基因是如何相互作用的，方法是使用慢病毒基因传递系统进入2月龄雄性Sprague-Dawley大鼠的纹状体。野生型α-突触核蛋白的病毒表达导致α-突触核蛋白的积累，并与细胞死亡和炎症增加有关。α-突触核蛋白增加PLK2水平和GSK-3β活性，并增加磷酸化α-突触核蛋白和Tau水平。Parkin联合表达降低磷酸化α-突触核蛋白水平，并减轻细胞死亡和炎症。Parkin降低了PLK2水平，增加了PP2A激活。

结论：这些数据表明，帕金降低了α-突触核蛋白水平，改变了影响磷酸化α-突触核蛋白水平的磷酸酶和激酶活性之间的平衡。这些结果表明帕金对α-突触核蛋白诱导的PD毒性具有新的保护机制。

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数字

图1
图1
A） 。α-Synuclein基因转移动物模型的建立及parkin对总α-Synuglein水平的影响编码人类α-突触核蛋白和人类野生型及突变体T240R parkin的慢病毒克隆的示意图。B）。使用4-12%NuPAGE SDS凝胶（Invitrogen）和parkin（PRK8）、α-突触核蛋白抗体和C）对纹状体脑提取物进行Western blot分析。密度分析。D） ●●●●。使用4-12%NuPAGE SDS凝胶（Invitrogen）和parkin（PRK8）和α-Synuclein抗体对感染T240R突变parkin和人类α-Synuglein的M17细胞提取物进行Western blot分析。E） ●●●●。注射E）的20微米厚大鼠纹状体切片的Parkin免疫滞留（PRK-8）。慢病毒LacZ（Lv-LacZ），F）。慢病毒parkin（Lv-Par），G）。慢病毒α-突触核蛋白（Lv-Syn）和H）。慢病毒parkin+慢病毒α-突触核蛋白（Lv-Par+Lv-Syn）。在注射I）的大鼠纹状体切片中，使用人抗α-突触核蛋白抗体进行免疫反应，然后进行DAB染色。慢病毒LacZ，J）。慢病毒parkin，K）。慢病毒α-突触核蛋白和L）。慢病毒parkin+α-突触核蛋白。星号与LacZ对照组差异显著，ANOVA，Neumann-Keuls多重比较N=4，P<0.05。
图2
图2
基因转移动物模型中α-突触核蛋白诱导的细胞死亡和parkin保护注射A）的大鼠纹状体切片银染。慢病毒LacZ，B）。慢病毒parkin和C）。慢病毒α-突触核蛋白（箭头表示银阳性细胞）和D）。慢病毒parkin+α-突触核蛋白。在慢病毒lacZ（图2E）、parkin（图2F）、α-突触核蛋白（图2G）和parkin+α-突触核蛋白（图2H）注射的脑中用TH抗体染色的大鼠纹状体切片。注射I）的大鼠脑SN 20微米厚切片中的银染色。慢病毒LacZ，J）parkin，K）。α-突触核蛋白和L）。parkin+α-突触核蛋白。来自注射有M的大脑的SN神经元的TH染色）。慢病毒LacZ，N）parkin，O）。α-突触核蛋白和P）。parkin+α-突触核蛋白。Q） ●●●●。柱状图表示caspase-3活性测定。星号与LacZ对照组差异显著，ANOVA，Neumann-Keuls多重比较N=4，P<0.05。
图3
图3
α-突触核蛋白诱导的神经炎症和帕金保护用小胶质细胞IBA-1抗体对注射A）的大鼠脑20微米厚纹状体切片进行免疫染色。慢病毒LacZ（Lv-LacZ），B）。停车场（Lv-Par），C）。α-突触核蛋白（Lv-Syn）和D）。慢病毒parkin+α-突触核蛋白（Lv-Par+Lv-Syn）。注射E）的大鼠纹状体星形胶质细胞GFAP免疫染色。慢病毒LacZ，F）。parkin，G）。α-突触核蛋白和H）。慢病毒parkin+α-突触核蛋白I）。直方图表示IBA-1和GFAP阳性细胞的体视学计数。J） ●●●●。在10%NuPAGE SDS凝胶（Invitrogen）和I）上分析纹状体提取物中TNF-α和iNOS的蛋白质印迹。免疫印迹的密度分析，Asterisk与LacZ对照组或如图所示，ANOVA显著不同，Neumann-Keuls多重比较N=4，P<0.05。
图4
图4
α-突触核蛋白诱导GSK-3β和Tau超磷酸化激活及帕金保护.A）。纹状体脑提取物在Nu-PAGE SDS 10%凝胶（Invitrogen）和B上的Western blot分析。密度分析显示GSK-3β活性。C） ●●●●。Western blot分析显示不同的Tau表位和。B） 免疫印迹密度分析中，Asterisk有显著差异，ANOVA，与Neumann-Keuls多重比较N=4，P<0.05。
图5
图5
Parkin表达阻止α-突触核蛋白磷酸化并增加磷酸酶活性.A）。α-Synuclein分离的α-Synuglein WB稳定转染MN9 D细胞并感染慢病毒parkin和B）。使用4-12%NuPAGE SDS凝胶（Invitrogen）对纹状体脑提取物进行WB分析，并用各种α-突触核蛋白抗体和PLK2抗体进行探测。C、 D&E）。用%对照表示的斑点密度测定。F） ●●●●。纹状体脑提取物蛋白磷酸酶2A亚基的WB分析。G） ●●●●。用%对照表示的斑点密度测定。H） ●●●●。α-Synuclein的WB稳定转染慢病毒parkin感染的MN9 D细胞，并用PP2A抑制剂冈田酸处理，以及I）T240R突变体和PP2A亚单位的WB。J） ●●●●。磷酸酶活性测定。星号是差异显著，ANOVA与Neumann-Keuls多重比较动物N=4，MN9 D细胞N=6，P<0.05。
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