跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

网站是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2010年11月15日；24(22):2543-55.
doi:10.1101/gad.1967810。 Epub 2010年10月21日。

DEAD-box RNA结合蛋白p68和类固醇受体RNA激活剂SRA介导CTCF转录隔离

姚红杰 1, 凯文·布里克, 伊冯·埃夫拉德, 挑江晓, R丹尼尔·卡梅里尼·奥特罗, 加里·费尔森菲尔德
附属公司

DEAD-box RNA结合蛋白p68和类固醇受体RNA激活剂SRA介导CTCF转录隔离

姚红杰等。 基因开发. .

摘要

CCCTC-binding factor（CTCF）是一种DNA结合蛋白，在染色质组织中起重要作用，尽管CTCF实现这些功能的机制尚不完全清楚。最近的研究表明，CTCF将凝集素复合物招募到绝缘体位置，而凝集素是绝缘体活性所必需的。在这里，我们发现DEAD-box RNA解旋酶p68（DDX5）及其相关的非编码RNA、类固醇受体RNA激活剂（SRA）与CTCF形成复合物，CTCF对绝缘体功能至关重要。在IGF2/H19印迹控制区（ICR）的CTCF位点以及其他基因组CTCF部位检测到p68。体内SRA或p68的缺失降低了IGF2/H19 ICR处CTCF介导的绝缘体活性，增加了IGF2表达水平，增加了内胚层增强子和IGF2启动子之间的相互作用。p68/SRA也与粘着蛋白复合体的成员相互作用。p68或SRA的缺失不会影响CTCF与其基因组位点的结合，但会降低凝集素结合。结果表明，p68/SRA通过与CTCF结合来稳定粘结蛋白与CTCFs的相互作用，这是实现适当绝缘体功能所必需的。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
RNA-结合蛋白p68与岛叶结合蛋白CTCF相互作用。(A类)来自稳定表达Flag或Flag标记的人CTCF的HeLa细胞的NE用于Flag co-IP实验，并用抗Flag和抗p68抗体进行免疫印迹分析。(B类)用兔IgG或兔抗p68抗体沉淀HeLa NEs，如顶部沉淀物用抗体进行免疫印迹，如正确的面板的。(C类)NIH3T3 NEs用小鼠IgG或小鼠抗CTCF抗体沉淀，如顶部并用抗体对沉淀进行免疫印迹，如正确的面板的。(D类)从HeLa NEs中分离的输入蛋白、GST-相关蛋白和GST-CTCF相关蛋白的Western blot用抗p68抗体进行检测。(E类)用抗CTCF抗体检测HeLa NEs分离的输入蛋白、GST-相关蛋白和GST-p68相关蛋白的Western blot。(F类)GST-CTCF及其在GST下拉分析中的删除的示意图。(G公司,顶部面板）仅使用固定化GST或重组GST-CTCF N末端（GST-CTCFR-N）、锌指（GST-CT CF-ZF）、C末端（GST-CTCF-C）和全长（GST-CTCF-FL）蛋白进行GST下拉分析，并通过Western blot检测抗p68抗体。(底部面板）Ponceau S染色，显示Western blot前膜上存在总蛋白。车道1和2分别占输入蛋白质样品的5%和2%。(H（H）)GST-p68及其在GST下拉分析中的缺失的示意图。(我,顶部面板）仅使用固定化GST或重组GST-p68 N末端（GST-p68-N）、RNA解旋酶核心区（GST-p 68-M）、C末端（GST p68-C）和全长（GST-p68-FL）蛋白进行GST下拉分析，并通过Western blot检测抗CTCF抗体。(底部面板）Ponceau S染色，显示Western blot前膜上存在总蛋白。
图2。
图2。
p68与CTCF的结合依赖于RNA。HeLa NEs与纯化的GST或固定在谷胱甘肽珠上的全长GST-CTCF融合蛋白在4°C下孵育过夜，存在（+）或不存在（-）DNase I(A类)或RNase A(B类). 然后用抗p68抗体对斑点进行检测。胭脂红S染色A类和B类在蛋白印迹前显示膜上的总蛋白。(C类)用越来越多的RNase A消化来自HeLa NEs的CTCF co-IP，分离成上清液（Sup.）和珠（Beads）组分，然后用CTCF或p68抗体进行免疫印迹。
图3。
图3。
非编码RNA SRA与CTCF结合。来自稳定表达Flag或Flag标记的人CTCF的HeLa细胞的NE用于Flag-co-IP实验，并通过抗SRAP和抗Flag抗体的免疫印迹进行分析(A类)或提取总RNA并用SRA和GAPDH特异性引物进行RT-PCR(B类). (C类,D类). 用小鼠IgG或小鼠抗CTCF抗体沉淀HeLa NEs。然后用抗CTCF或抗SRAP抗体对样品进行免疫印迹(C类)或提取总RNA并用SRA和GAPDH特异性引物进行RT-PCR(D类). (E类)用小鼠IgG或小鼠抗CTCF抗体沉淀对照（Ctrl）siRNA和SRA siRNA缺失的HeLa NEs，并用抗p68抗体进行免疫印迹(顶部)或抗SRAP抗体(中间的)或提取RNA，并使用SRA特异性引物通过RT-PCR分析样品(底部).
图4。
图4。
CTCF介导的绝缘体功能需要p68和SRA。(A类)报告人构建用于增强子阻断分析的pIHLIE和pIHLME的示意图。在pIHLIE中，CTCF与H19 ICR结合，并通过阻断增强子进入启动子来抑制荧光素酶基因表达。在pIHLME中，CTCF结合位点发生突变。（英语）增强剂；（H19P）小鼠H19启动子；（Mut）突变的ICR。(B类)用pIHLIE或pIHLME和肾素荧光素酶控制质粒转染CTCF或p68 shRNA-缺失的HeLa细胞。在荧光素酶质粒转染48小时后采集细胞并测量荧光素素酶活性。测定每个细胞裂解物的相对荧光素酶活性，并与对照shRNA进行标准化(C类)用SRA siRNA耗尽HeLa细胞，然后，24小时后，用pIHLIE或pIHLME和肾萤光素酶对照质粒转染。在荧光素酶质粒转染24小时后采集细胞并测量荧光素素酶活性。测定每个细胞裂解物的相对荧光素酶活性，并根据对照siRNA进行标准化(D类)绝缘体分析中使用的pNI对照和pNI-5′HS4核心绝缘体质粒的示意图。pNI或pNI-core的质粒主干是pGEM4Z。pNI-core包含鸡β-珠蛋白HS4核心绝缘体片段的两个拷贝，位于小鼠HS2增强子和Y-新霉素(尼奥)报告基因和阻断HS2增强子与尼奥报告基因。(E类)用CTCF或p68 shRNA去除K562细胞，并用pNI或pNI-core质粒和GFP质粒转染。收集细胞，分离RNA进行逆转录，以检测转染24小时后Neo报告基因的表达。Neo的表达相对于GFP的表达进行标准化。(F类)用pNI或pNI-core转染SRA-siRNA-缺失的K562细胞。收集细胞，分离RNA进行逆转录，以检测转染24小时后Neo报告基因的表达。测定每个细胞裂解物的相对新霉素表达，并对照对照shRNA进行标准化(E类)或控制siRNA(F类)样品。数据由Student’s分析t吨-测试。对于所有面板，条形图表示n个= 3. (*)P（P）< 0.01.
图5。
图5。
p68和SRA在IGF2/H19型轨迹。人类RT-qPCR分析H19型(A类)和IGF2型(B类)小鼠p68–shRNA-和CTCF–shRNA缺失HeLa细胞中的转录物H19型(C类)和IGF2型(D类)p68–shRNA-和CTCF–shRNA缺失小鼠原代MEF细胞和人类的转录物H19型(E类)和IGF2型(F类)对照和SRA siRNA-缺失HeLa细胞中的转录物。转录水平标准化为人类或小鼠HPRT1水平，然后是对照shRNA或siRNA样本。数据由Student’s分析t吨-测试。误差线表示平均值±标准偏差。（*）P（P）< 0.05; (**)P（P）< 0.01.
图6。
图6。
p68与母体等位基因的结合IGF2/H19型ICR依赖于CTCF和SRA。(A类)用抗CTCF或正常兔血清免疫沉淀HeLa细胞的交叉链接DNA-蛋白复合物，然后用特异性引物进行qPCR扩增IGF2/H19型ICR CTCF结合区和阴性对照区（chr11:1983833–1983994）（Wendt等人，2008年）。值以输入百分比表示。(B类)p68入住率的ChIP分析IGF2/H19型用小鼠抗p68抗体、兔抗p68和山羊抗p68单克隆抗体或IgG从HeLa细胞免疫沉淀的染色质进行ICR CTCF结合位点的检测。通过qPCR分析沉淀的DNA。(C类)利用MEF细胞中的CTCF、p68或IgG抗体进行等位基因特异性ChIP分析。输入和沉淀样本对父母亲进行半定量PCRH19型ICR等位基因，然后用限制性内切酶Tsp45I（一个多态性限制性位点）消化。(D类)维恩图显示p68和CTCF结合位点的重叠。(E类)Western blot分析CTCF shRNA或空载体稳定表达HeLa细胞的NEs中CTCF和p68水平。β-肌动蛋白作为负荷对照。(F类,G公司)与CTCF相关的分离DNA的ChIP-qPCR分析(F类)和第68页(G公司)在IGF2/H19型CTCF-depleted HeLa细胞的ICR（平均值±SDn个= 3). (H（H）)HeLa细胞SRA敲除效率的RT-qPCR分析（平均值±SDn个= 3). (我,J)CTCF相关DNA的ChIP-qPCR分析(我)和第68页(J)位于CTCF绑定站点IGF2/H19型SRA缺失HeLa细胞的ICR（平均值±SDn个= 3).
图7。
图7。
p68和凝集素之间的功能关系。(A类)HeLa NEs的GST下拉分析(顶部面板）或体外翻译的SMC1(底部面板）仅使用固定化GST或重组GST-p68。用Western blot分析凝集素亚基SMC1的结合蛋白；p72作为体内分析的阳性对照。(B类)CTCF结合位点与凝集素亚基SMC1和SMC3相关的分离DNA的ChIP-qPCR分析胰岛素样生长因子2/H19p68缺失HeLa细胞中的ICR。(C类)CTCF结合位点SMC3相关DNA的ChIP-qPCR分析H19型SRA缺失HeLa细胞的ICR。（CK）控制。(D类)与p68相关的CTCF结合位点分离DNA的ChIP-qPCR分析IGF2/H19型SA2-缺失HeLa细胞的ICR。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Barski A、Cuddapah S、Cui K、Roh TY、Schones DE、Wang Z、Wei G、Chepelev I、Zhao K，2007年。人类基因组组蛋白甲基化的高分辨率分析。手机129:823–837-公共医学
    1. Bartolomei理学硕士，Zemel S，Tilghman SM 1991。小鼠H19基因的父母印记。自然351:153–155-公共医学
    1. Bates GJ、Nicol SM、Wilson BJ、Jacobs A-MF、Bourdon J-C、Wardrop J、Gregory DJ、Lane DP、Perkins ND、Fuller-Pace FV 2005。DEAD盒蛋白p68：一种新的p53肿瘤抑制因子的转录辅激活因子。EMBO期刊24:543–553-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bell AC，Felsenfeld G 2000。CTCF依赖性边界的甲基化控制Igf2基因的印迹表达。自然405:482–485-公共医学
    1. Bell AC，West AG，Felsenfeld G，1999年。脊椎动物绝缘体的增强子阻断活性需要蛋白质CTCF。手机98:387–396-公共医学

出版物类型

MeSH术语

赠款和资金