Effect of pseudouridylation on the structure and activity of the catalytically essential P6.1 hairpin in human telomerase RNA

doi:10.1093/nar/gkq525

.2010年10月；38(19):6746-56.

doi:10.1093/nar/gkq525。 Epub 2010年6月16日。

假尿苷化对人端粒酶RNA中催化必需P6.1发夹结构和活性的影响

Nak-Kyoon Kim公司¹, 卡拉·A·泰默, 詹姆斯·米切尔, 柯林斯, 朱利·费贡

附属公司

PMID： 20554853
PMCID公司： PMC2965242型
内政部： 10.1093/nar/gkq525

假尿苷化对人端粒酶RNA中催化必需P6.1发夹结构和活性的影响

金娜坤等。核酸研究. 2010年10月.

.2010年10月；38(19):6746-56.

doi:10.1093/nar/gkq525。 Epub 2010年6月16日。

作者

Nak-Kyoon Kim公司¹, 卡拉·A·泰默, 詹姆斯·米切尔, 柯林斯, 朱利·费贡

附属

¹美国加州大学洛杉矶分校化学和生物化学系，邮编90095。

PMID： 20554853
PMCID公司： PMC2965242型
内政部： 10.1093/nar/gkq525

摘要

端粒酶通过添加保守的端粒DNA重复序列来延长线性染色体的3'末端，对细胞增殖和基因组稳定性至关重要。所有生物体的端粒酶都含有端粒酶逆转录酶和端粒酶RNA（TER），它们共同为体外催化活性提供了最低限度的功能元素。许多功能性核糖核蛋白的RNA成分含有修饰核苷酸，包括保守的假尿苷（Ψs），它们对结构和活性有细微影响。我们已经确定了人类TER中潜在的Ψ修饰位点。预测的Ψs中有两个位于对端粒酶催化活性至关重要的CR4-CR5结构域的基本P6.1发夹环中。我们研究了P6.1假尿苷化对其溶液核磁共振结构、折叠热力学稳定性和体外端粒酶活化的影响。与未改性P6.1相比，假尿苷化P6.1具有显著不同的环结构，稳定性增加。环核苷酸与相邻残基的相互作用程度与Ψ-修饰P6.1结构中环核苷酸进化序列的保守性程度更为相似。P6.1的假尿苷修饰略微减弱端粒酶活性，但略微增加体外加工能力。我们的结果表明，Ψs可能通过影响TER-TERT或TER-TER相互作用对人类端粒酶活性产生微妙的影响。

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数字

**图1。**
hTER的二级结构和Ψ的结构。(A类)尿苷和Ψ的结构比较。(B类)未修饰P6.1（左）和Ψ修饰（右）畴的二级结构。赖特:自然发生的Ψ修饰位点以红色显示，在被取代的茎中有两个Ψs体外黑体RNA合成。左侧:在脊椎动物TER中，上部绿色、下部绿色和黑色残基分别代表100%、≥80%和<80%的保守核苷酸。在P6.1和Ψ4-P6.1中，终端G-C对（盒）并非来自自然hTER序列。hTER的二级结构显示假结/核心、CR4-CR5、CR7和H/ACA域。假定Ψ修改位置用箭头表示，P6.1子域用红色圈出。

**图2。**
hTER中Ψ修饰位点的识别。Ψs被检测为从富含内源性hTER的HeLa提取物部分对修饰RNA引物延伸的终止。通道1：未经处理的RNA作为模板；通道2和3：CMC模拟处理或CMC处理的RNA作为模板。在Ψ修饰的潜在位点之前发生一个核苷酸的RT终止用星号标记。通道4-7：用ddNTP混合物对重组模板进行RT，以生成测序阶梯。非特定背景图案是以高增益扫描长时间射线照射的伪影，这是可视化微弱信号所必需的。显示了hTER 5′-端完全合成的RT产物（FL-ehTER）。(A类)使用与hTER核苷酸443-419互补的引物进行引物延伸。(B类)使用与hTER核苷酸235–211互补的引物进行引物延伸。

**图3。**
Ψ4-P6.1的核磁共振谱以及与P6.1的比较。(A类)1D亚微米（600 MHz，10°C）和2D NOESY（600 MHz、10°C，τ_米 = 250 ms）Ψ4-P6.1的光谱。(B类)Ψ4-P6.1（黑色，600 MHz，τ_米 = 200 ms）和P6.1（红色，800 MHz，τ_米 = 150毫秒）。残留物305、308、309和310以及Ψs和Us之间的化学位移差异很大。

**图4。**
假尿苷化P6.1（Ψ4-P6.1）的核磁共振溶液结构。(A类)20个最低能量结构在所有重原子上的叠加。(B类)Ψ4-P6.1最低能量结构的立体视图。磷酸盐骨架由灰色带状物勾勒出来。在（A）和（B）中，核苷酸A、Ψ、G和C分别用黄色、绿色、蓝色和红色表示。

**图5。**
Ψ4-P6.1和P6.1环区的详细三级结构。从最低能量结构的回路立体视图(A类)Ψ4-P6.1和(B类)P6.1[PDB ID:1OQ0；（32）]。核苷酸是彩色编码的，如图2B所示。中U•G摆动对的比较(C类)Ψ4-P6.1(D类)P6.1和(E类)UUCG四环路[PDB ID:1F7Y；（56）]。

**图6。**
直接端粒酶活性测定体外用hTERT和hTER组分重组端粒酶。(A类)FL-hTER（核苷酸1–451）、假结/核+CR4-CR5、假结-核+CR5318和核+Ψ3CR5318的直接分析显示在通道2–5。通道1：无RNA的模拟反应。15-nt³²指示了P-5′-末端标记的DNA负载对照（L.C.）。(B类)CR5318的二级结构，其Ψ修改位置用楔形符号标记。相对端粒酶活性(C类)和处理能力(D类)显示了（A）中列出的RNAs。加工率=−ln2/（2.303k），其中k个是线性拟合的斜率（61）。

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