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.2010年5月13日；6（5）：e1000942。
doi:10.1371/journal.pgen.1000942。

通过高通量测序对块状分离物进行分析，发现酿酒酵母中一个新的木糖利用基因

贾里德·温格 1, 卡佳·施瓦茨, 加文·夏洛克
附属公司

通过高通量测序对块状分离物进行分析，发现酿酒酵母中一个新的木糖利用基因

贾里德·温格等。 公共科学图书馆-基因. .

摘要

木糖发酵是木质纤维素生物质高效生产乙醇的基本要求。尽管它们能积极发酵己糖，但长期以来人们一直认为本地酿酒酵母菌株不能在木糖上发酵或非发酵生长。人口调查发现了一些天然产生的木糖弱阳性菌株，一些酿酒酵母已通过基因工程来发酵木糖，但尚未有任何天然或工程菌株能像葡萄糖一样有效地发酵木糖。在这里，我们使用了一个穿透介质的筛网来鉴定当木糖作为唯一碳源时可以增加光密度的酵母菌菌株。我们鉴定了38株具有这种木糖利用表型的菌株，包括酿酒酵母菌株、其他严格感官成员以及它们之间的杂种。我们鉴定的所有酿酒酵母木糖利用菌株都是葡萄酒酵母，对于那些能够产生减数分裂后代的菌株，木糖表型分离为单个基因特征。我们使用平铺微阵列和高通量测序通过批量分离分析（BSA）对该基因进行了定位。该基因是一种假定的木糖醇脱氢酶，我们将其命名为XDH1，位于染色体XV右端的亚球形区域，该区域在S288c参考基因组中不存在。我们通过执行基因表达微阵列和遗传解剖内源性酵母木糖途径进一步表征木糖表型。我们已经证明，天然酿酒酵母能够利用木糖作为唯一碳源，描述了这一特性的遗传基础以及内源木糖利用途径，并证明了利用高通量测序进行BSA的可行性。

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数字

图1
图1。内源性木糖途径。
生化活性标记为红色的典型还原-氧化（真菌）和异构化（细菌和真菌）途径酿酒酵母酶呈蓝色（在酿酒酵母).
图2
图2。葡萄酒菌株表现出由单个基因控制的木糖利用表型。
这些面板显示了在TECAN中测量的增长曲线。将曲线归一化为第一个时间点，并从这些和显示的所有其他生长曲线的分析中删除由于海藻糖（存在于YP中）引起的初始生长阶段。（A）酿酒酵母（Simi White）和杂交（CBS1502）在YP培养基中生长。（B–E）Simi White的完整四分体；拉文AC；Simi White×S288c；和Simi White×Lalvin AC。（F）该表代表了所有能够杂交的葡萄酒菌株，并且都显示了木糖利用与木糖不利用的4∶0分离。
图3
图3。利用Affymetrix酵母贴片微阵列进行批量分离物分析。
利用或不利用木糖分离物池中的基因组DNA与Affymetrix平铺微阵列独立杂交。此处绘制的是对数的比率2木糖非利用强度和木糖利用基因芯片实验沿着染色体XV。
图4
图4。65kb插入到第XV号染色体的粒下区。
这张图显示了一些葡萄酒菌株常见的新的染色体XV亚群区域内开放阅读框的位置。蓝色方框表示假定的木糖醇脱氢酶同系物的位置。数字框表示从以下位置创建的天鹅绒轮廓从头开始从三个正池编译的已筛选（solid=Watson strand，hashed=Crick strand）、未映射读取的程序集。黑盒代表由EC1118葡萄酒酵母基因组序列确定的65kb区域，该序列用于绘制Simi White未映射读码，并找到该区域中所有打开的读码框。
图5
图5。新型XDH同系物对于木糖的利用是充分和必要的。
用pGS104（pRS316:：XDH1型)，仅用pRS316转化的实验室菌株，用pGS104转化但允许丢失质粒的实验室菌株和（B）两个带有xdh1Δ：：KanMX破坏和他们的父母。
图6
图6。内源性木糖途径的遗传解剖。
量化交叉到Simi-White单倍体衍生背景（GSY2469）中的指示缺失随时间增加的OD。在最小培养基中的TECAN平板阅读器中测量生长。根据木糖斜率计算的OD增加量——无碳减量* = 与GSY2469（木糖+）相比，两个样本t检验中的p<0.05和**=p<0.01。XR=木糖还原酶；XDH=木糖醇脱氢酶；XK=木尿激酶。误差条显示平均值的标准误差。
图7
图7。内源性木糖途径基因表达。
假定木糖途径基因的相对mRNA丰度（与所有样本的合并参考值相比）。值为平均值Log2每个时间点3个生物复制品之间的（样本/参考）比率。时间0是从饱和YPD培养基接种到“木糖”（最小培养基中2%木糖）或“无碳水化合物”（最小介质中无碳源）后的立即时间。每8小时记录一次时间点，持续72小时。
图8
图8。基因表达时间进程。
K-means（K=10）本研究和其他三个数据集的基因表达值聚类。在这项研究中，1266个基因在至少一次两级（配对时间进程）SAM分析中都发生了显著变化（见结果）。本研究的数值为时间零点转换相对mRNA丰度（与本研究所有样本的合并参考值相比），并在每个时间点的3个生物复制品中取平均值。从左到右依次为木糖阳性菌株（2%木糖）、木糖阳性菌（无碳源）、木糖阴性菌（2%木糖）、木聚糖阴性菌（无炭源）。“生长率”数据由计算得出，并显示给定基因对更高生长率的转录反应的强度和方向。“双向移位”是来自的零转换数据，所有其他数据都来自；同样，所有时间进程都是零转换的。（†，б表示结果中讨论的小个子组。）
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