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。2010年3月19日；285(12):9172-9.
doi:10.1074/jbc。M109.092130。 Epub 2010年1月21日。

卷曲8.Wnt3a的重组。LRP6信号复合物揭示了LRP6上的多个Wnt和Dkk1结合位点

埃里克·鲍希斯 1, 克里斯汀·谭, 伊冯娜·弗兰克, J费尔南多·巴赞, 詹姆斯·恩斯特, 黄继英（Jiyoung Hwang）, 迈克·科斯塔, 安德烈亚·科克伦, 拉米·汉诺什
附属公司

卷曲8.Wnt3a的重组。LRP6信号复合物揭示LRP6上的多个Wnt和Dkk1结合位点

埃里克·鲍希斯等。 生物化学杂志。 。

摘要

Wnt/β-catenin信号通过分泌的Wnt与其受体Frizzled（Fz）和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（LRP5/6）的结合在细胞表面启动。这些分子相互作用的研究一直是一个重大的技术挑战，因为蛋白质的纯度和数量都不高。在本报告中，我们描述了昆虫细胞表达和纯化可溶性小鼠Fz8半胱氨酸富集结构域和人LRP6细胞外结构域，并表明它们在细胞测定中抑制Wnt/β-连环蛋白信号传导。我们测定Wnts和Dickkopf 1（Dkk1）与相关共受体的结合亲和力，并在体外重建Fz8 CRD。Wnt3a。LRP6信号复合体。使用LRP6的纯化片段，我们进一步表明Wnt3a与仅包括LRP6的第三和第四β-螺旋桨结构域的区域结合（E3E4）。令人惊讶的是，我们发现Wnt9b与LRP6胞外结构域E1E2的不同部分结合，并且我们证明Wnt3a和Wnt9a可以同时与LRP5结合。Dkk1结合E1E2和E3E4片段，并与Wnt3a和Wnt9b竞争结合LRP6。LRP6共受体上存在多个独立的Wnt结合位点，这为Wnt信号复合物的结构和Dkk1广谱抑制Wnt/β-catenin信号的模型提供了新的可能性。

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数字

图1。
图1。
可溶性LRP6 ECD通过直接结合Wnt3a抑制Wnt3a-介导的β-catenin稳定。 A类，所示为C末端生物素化LRP6 E1E4（涂于链霉亲和素生物传感器尖端）与溶液中Wnt3a之间的结合分析(K（K）D类=9牛顿米).B类，显示LRP6片段对Wnt3a介导的β-catenin稳定性的影响。在恒定浓度Wnt3a（0.6 n米). 该浓度是预先确定的，以稳定细胞内β-连环蛋白，并在检测中产生良好的信噪比。FL ECD（仪表盘50=480牛顿米)和E1E4片段（IC50=360牛顿米)抑制β-catenin稳定，这表明不需要LDLa区域。E1E2和E3E4具有IC50值超过2μ米，这表明E1E4区域是完全抑制所必需的。
图2。
图2。
Dkk1通过与Wnt3a竞争结合LRP6来抑制Wnt3a-介导的β-catenin稳定。 A类，显示了涂覆在链霉亲和素生物传感器上的C-末端生物素化的LRP6 E1E4和溶液中的Dkk1之间的直接结合测定(K（K）D类=3牛顿米).B类，Wnt3a与LRP6的结合在Dkk1的存在下受到抑制。Dkk1预绑定到LRP6（原始数据位于补充图S2)抑制Wnt3a与LRP6的结合。LRP6未被Dkk1饱和，导致残余Wnt3a结合。C类图中所示为Dkk1对Wnt3a介导的β-连环蛋白稳定（IC）的抑制50=100牛顿米). Wnt3a浓度为0.6 n米。
图3。
图3。
Fz8-CRD和LRP6形成Wnt3a介导的三重复合物。 A类图中所示为纯化的Fz8 CRD在纯化的Wnt3a存在下对纯化的LRP6 E1E4的下拉。纯化全长Dkk1防止三元络合物形成(第四车道)通过与Wnt3a竞争LRP6绑定。IP（IP），免疫沉淀。B类图中所示为Fz8 CRD（涂于抗人Fc生物传感器上）的C端Fc融合物与Wnt3a和LRP6的直接结合。第一步对应于Fz8 CRD加载，并显示Fc融合与抗人Fc生物层之间的相互作用。在清洗步骤之后，Wnt3a在Fz8 CRD上加载一段较长的时间，以形成二元络合物。第三步对应于LRP6 E1E4与预成型Fz8·Wnt3a二元复合物的结合(蓝色痕迹)在Wnt3a浓度恒定的情况下。在缺少Wnt3a的情况下，LRP6不会与Fz8 CRD交互(橙色轨迹). 这个绿色痕迹用作负控制，不加载Fz8 CRD。
图4。
图4。
多个Wnts在LRP6的不同位点结合。 A类，显示Wnt9b的预绑定(红色痕迹)至LRP6 E1E4不阻止Wnt3a结合（与蓝色痕迹)表明LRP6上有两个独立的Wnt结合位点。B类Wnt9b与LRP6 E1E2紧密结合，而Wnt3a没有结合。C类，Wnt3a与LRP6 E3E4结合，而Wnt9b不结合。
图5。
图5。
提出了Fz8·Wnt3a·LRP6复合物形成模型及其由Dkk1调控。 A类，Fz8 CRD与LRP6的结合由Wnt3a与E3E4的结合介导。Dkk1与Wnt3a竞争LRP6的绑定。B类，两个Dkk1分子在LRP6上的不同位置结合，并抑制Wnt3a和Wnt9b的结合。C类、Wnt3a和Wnt9b在不同位置同时与LRP6受体结合。一个LRP6分子可以在细胞表面招募两个Wnt·Fz复合物，从而促进Fz受体的聚集并启动不同的下游Wnt反应。
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