Alpha-actinin2 cytoskeletal protein is required for the functional membrane localization of a Ca2+-activated K+ channel (SK2 channel)

doi:10.1073/pnas.0908207106

.2009年10月27日；106(43):18402-7.

doi:10.1073/pnas.0908207106。 Epub 2009年10月8日。

钙激活的K+通道（SK2通道）的功能膜定位需要α-肌动蛋白2细胞骨架蛋白

玲珑路¹, 瓦列里·蒂莫菲耶夫, 李宁, 萨桑·拉菲扎德, 阿尼尔·辛加普里, 托德·哈里斯, 尼帕万·恰姆维蒙瓦特

附属公司

PMID： 19815520
PMCID公司： PMC2775294型
内政部： 10.1073/pnas.0908207106

钙激活的K+通道（SK2通道）的功能膜定位需要α-肌动蛋白2细胞骨架蛋白

玲珑路等。美国国家科学院程序. 2009.

.2009年10月27日；106(43):18402-7.

doi:10.1073/pnas.0908207106。 Epub 2009年10月8日。

作者

玲珑路¹, 瓦列里·蒂莫菲耶夫, 李宁, 萨桑·拉菲扎德, 阿尼尔·辛加普里, 托德·哈里斯, 尼帕万·恰姆维蒙瓦特

附属

¹美国加州大学戴维斯分校医学系心血管内科，邮编：95616。linglu@njnu.edu.cn。

PMID： 19815520
PMCID公司： PMC2775294型
内政部： 10.1073/第908207106页

摘要

适当的离子通道运输的重要性得到了许多与通道相关的遗传病的支持，这些疾病的缺陷与未能到达细胞表面有关。从概念上讲，有理由认为离子通道的功能关键取决于精确的亚细胞定位和细胞表面膜上通道蛋白的数量，这是由分泌和内吞途径共同决定的。然而，整个离子通道贩运途径的确切机制仍然未知。这里，我们直接证明了小电导Ca（2+）激活的K（+）通道（SK2或K（Ca）2.2）的适当膜定位依赖于其相互作用蛋白α-肌动蛋白2，一种主要的F-肌动蛋白交联蛋白。SK2通道在细胞表面膜上的定位是动态调节的，其中一个关键步骤包括SK2通道通过其相互作用蛋白α-肌动蛋白2的细胞骨架锚定过程，以及通过早期内体回细胞膜的内吞再循环过程。因此，SK2通道再循环的这些成分的改变导致通道表面表达的深刻变化。鉴于类似的细胞骨架相互作用和锚定可能对神经元和其他可兴奋细胞中其他离子通道的膜定位至关重要，我们的发现的重要性可能超越了K（+）通道的范围。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
α-肌动蛋白2细胞骨架蛋白有助于SK2通道在HEK 293细胞质膜上的正确定位。(A类)来自单独用SK2通道转染并用抗SK2抗体处理的HEK 293细胞的共聚焦图像（绿色，左侧)细胞核的DAPI染色（蓝色，中部). 合并的图像(赖特)显示了SK2通道蛋白主要在胞浆中的定位模式。(B类)与SK2通道和α-肌动蛋白2共转染的HEK 293细胞的共聚焦图像，并在稳定转染细胞中用抗SK2和抗α-肌动蛋白2抗体染色(顶部)和瞬时转染细胞(底部).插入：如强度剖面分析所示，SK2通道和α-肌动蛋白2蛋白在质膜上的结肠化。(C类)抗SK2和抗α-肌动蛋白2抗体双重标记的HEK 293细胞共焦Z堆叠图像的三维重建。(D类)用NHS-LC-Biotin对单独转染SK2通道（SK2）的HEK 293细胞的SK2通道进行细胞表面生物素化，并与SK2通道和α-肌动蛋白2（SK2-Actn2）共同转染的细胞进行比较，用链霉亲和素珠拉下，用抗SK2抗体进行检测。信号被校正为通道蛋白输入并标准化(n个= 3; *,*P（P）*< 0.05). 显示了SK2通道的代表性细胞表面生物素化免疫印迹(赖特).

**图2。**
使用YTH分析绘制SK2通道和α-肌动蛋白2蛋白之间的相互作用位点。(A类)在高（SD/-Ade/-His/-Lue/-Trp/X-α-gal）和低（SD/-Leu/-Trp）强度的筛选介质上，使用YTH分析，SK2通道和α-actinin的不同突变体和野生型结构显示出不同的相互作用强度。使用具有p53的pGADT7-T作为阳性对照。使用β-半乳糖苷酶活性进一步量化SK2通道与α-肌动蛋白2的相互作用(赖特) (n个= 6; *,*P（P）*< 0.05). (B类)免疫荧光共焦显微图像。当pIRES-SK2与pcDNA3.1-Actn2-野生型（顶行）共同转染HEK 293细胞时，发现SK2通道和α-肌动蛋白2蛋白在质膜上的分布有明显重叠。当pIRES-SK2与pcDNA3.1-Actn2共同转染细胞时，第二行和第三行显示SK2通道的质膜定位水平较低^{多功能电视2}或pcDNA3.1-Actn2^{多功能终端3}底部的行显示了HEK 293细胞与SK2通道和仅包含2个钙蛋白酶同源结构域的截短的Actn2-N（aa 1–251）共转染，或者与仅包含杆状结构域的截短的Actn2-Rod（aa 344–745）共转染。值得注意的是，α-肌动蛋白2截短型的阴性免疫标记B类表明抗体（Sigma单克隆抗α-肌动蛋白肉瘤克隆EA-53）的表位可能位于α-肌动蛋白截短部分之外。(C类)顶行显示标记有反式-高尔基标记物（P230）和抗SK2抗体。第二、第三和第四行分别显示了标记有抗SK2和抗Rab8、抗Rab5或抗EEA1抗体的图像，显示了具有SK2通道的不同蛋白质之间的共定位差异。散点图（右栏）显示反式-具有SK2通道的高尔基体标记（P230）和EEA1与SK2通道之间的高度相关性。图像中的所有像素都已在散点图上指定了一个位置，并根据颜色（红色或绿色）的强度进行放置。底部一行显示了用120μM伯氨喹处理4小时后HEK 293细胞的免疫荧光共聚焦显微镜图像，标记有抗SK2和抗EEA1抗体。

**图3。**
SK2通道与钙中的α-肌动蛋白2相互作用²⁺-独立方式；此外，在载脂蛋白CaM的存在下，相互作用降低。(*A左边*)His-Actn2和GST-SK2重组融合蛋白示意图。数字是指这两种蛋白质的氨基酸。这两种蛋白都能被异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导并在大肠杆菌中表达。(赖特)用Ni-NTA琼脂糖纯化的6xHis标记的α-肌动蛋白2和经谷胱甘肽Sepharose纯化的GST标记的SK2通道重组C末端的表达分别用抗-His和抗-GST抗体以预测的大小通过Western blot检测（第3和第4道标记为puri）。通道1和通道2（标记为co-puri）是GST-SK2和His-Actn2蛋白共纯化后，抗-His和抗-GST抗体分别检测的Western blot结果。(B类)经Ponceau S染色的纯化和铜纯化蛋白表明，在不同浓度的钙存在下，His-Actn2可以与GST-SK2铜纯化²⁺和EGTA。(C类)在不同浓度的载脂蛋白CaM存在下，His-Actn2仍能与GST-SK2共纯化，但存在载脂蛋白CaM时，GST-SK 2与His-Acnt2之间的结合降低。

**图4。**
α-肌动蛋白2细胞骨架蛋白是新生儿心肌细胞正常SK2通道定位所必需的。(A类和B类)使用不同稀释度的cDNA通过半定量RT-PCR分析α-肌动蛋白2的mRNA水平(A类)和实时RT-PCR(B类)用针对α-肌动蛋白2或干扰siRNA（Ctrl）和非转染细胞（Ctrl-NT）的特异性siRNA处理的新生儿心肌细胞。根据半定量RT-PCR，与打乱siRNA相比，特定siRNA显著降低了α-肌动蛋白2 mRNA水平(A类)以及实时RT-PCR(B类). 以GAPDH mRNA水平作为对照。数值为平均值±SEM(n个= 6; *,*P（P）*< 0.05). (C类)Western blot分析显示兔抗肌动蛋白2单克隆抗体检测到的α-肌动蛋白蛋白水平(顶部)和单克隆抗α-肌动蛋白（肌聚体）抗体(中部)和GAPDH(底部)用于不同处理的培养乳鼠心肌细胞的负荷控制。因此，用兔抗α-肌动蛋白2单克隆抗体检测到的α-肌动蛋白2蛋白水平在特异性siRNA转染后显著降低(D类)使用抗SK2和抗α-肌动蛋白抗体对siRNA-治疗组或对照组进行免疫染色的共聚焦显微图像。α-肌动蛋白2特异性siRNA转导的心肌细胞α-肌动蛋白2染色显著降低；SK2通道表达异常，主要定位于胞浆。插图：原始标记区域的放大倍数较高。最下面一行显示了用siRNA处理的心肌细胞中异常定位的SK2通道与EEA1之间的高度相关性。

**图5。**
利用活性细胞成像和带抑制肽的斑贴灯记录技术探讨SK2通道细胞表面表达的动态调节。(A类)对转染CFP-SK2和α-肌动蛋白2质粒的HEK 293T细胞进行FRAP实验。插图：ROI的序列图像。PreBl、预漂白剂；Bl，漂白；PostBl，漂白剂。底部：漂白前后ROI的相对荧光强度。恢复时间常数（τ）为42.5±4.3 s(n个= 5). (B类)全细胞我_{K、钙}在建立全细胞构型（蓝线）、20分钟后（红线）和应用apamin（100 pM；黑线）后立即记录。在−120到+60 mV的电压范围内应用电压放大器协议，从−55 mV的保持电位开始，斜率为360 mV/s。SK2介导的全细胞我_{K、钙}来自pIRES2-EGFP-SK2和pcDNA3-α-肌动蛋白2质粒共转染的HEK 293T细胞(顶部)和我_{K、钙}从小鼠心房肌细胞记录(底部)使用控制肽和抑制肽。(C类)SK2渠道顺行和逆行贩运的工作模型。SK2通道直接与α-肌动蛋白2细胞骨架蛋白相互作用，这有助于将通道固定在心肌细胞的表面膜和T管状结构上（右侧路径）。α-肌动蛋白2的缺失可能导致内化速率增加和/或早期内体对表面膜的靶向性降低（左侧路径）。

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