Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration

doi:10.1371/journal.pone.0005777

.2009年6月3日；4（6）：e5777。

doi:10.1371/journal.pone.0005777。

在缺乏PINK1的老年小鼠中，帕金森氏症表现型伴随着渐进性线粒体功能障碍而无神经退行性变

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PMID： 19492057
预防性维修识别码：项目经理2686165
内政部： 10.1371/日志.pone.0005777

在缺乏PINK1的老年小鼠中，帕金森氏症表现型伴随着渐进性线粒体功能障碍而无神经退行性变

苏珊娜·吉斯佩特等人。公共科学图书馆一号. 2009.

.2009年6月3日；4（6）：e5777。

doi:10.1371/journal.pone.0005777。

附属

¹德国法兰克福大学医学院神经病学系。

PMID： 19492057
预防性维修识别码：项目经理2686165
内政部： 10.1371/journal.pone.0005777

摘要

背景：帕金森氏病（PD）是一种成人发病的运动障碍，病因不明。我们之前已经证明线粒体蛋白激酶PINK1（PTEN诱导的假定激酶1）的功能丧失突变导致PD的隐性PARK6变异体。

方法/主要发现：现在，我们产生了一只PINK1缺陷小鼠，并观察到了几种新的表型：在老年时，体重和自主运动活动选择性地逐渐减少。与帕金森病一样，老年黑质纹状体投射物中多巴胺水平异常伴随着运动减少。可能与PARK6综合征相一致，但与散发性PD相反，在PINK1缺乏的老年小鼠中，寿命缩短、脑干和交感神经功能障碍、路易小体内可见的α-同核蛋白聚集或黑质纹状体神经变性均不存在。然而，我们证明PINK1突变小鼠的线粒体前蛋白输入逐渐减少，与线粒体核心功能（如ATP生成和呼吸）缺陷相关。与PINK1对果蝇线粒体动力学的强烈影响相反，尽管裂变因子Mtp18的表达降低，但我们发现只有在PINK1-缺失的小鼠神经元受到应激时，线粒体的裂变减少，聚集增加。

结论：因此，衰老的Pink1（-/-）小鼠表现出线粒体功能障碍增加，导致类似PD的神经活动受损，而没有明显的神经元死亡。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。生成和表征*粉红色1* ^−/−鼠标。**
（A）目标策略示意图。（B）证明代表同源重组事件的等位基因*粉红色1*通过胚胎干细胞系外部探针的Southern blotting定位，（C）在外显子4扩增和AvaII限制后，纯合（hom）和杂合（het）小鼠尾部DNA中出现突变，表现为双带（134+154碱基对），而不是野生型（wt）单带（288 bp）。（D）缺少*引脚1*通过Northern印迹法，以β-actin为对照，以18S和28S核糖体带为大小参考，在纯合突变小鼠与杂合小鼠和野生型小鼠的三个组织中进行转录表达。另外一条交叉反应带的强度与突变基因型无关。无残留*粉红色1*检测到不同大小的转录物，表明突变mRNA的不稳定性和降解*粉红色1*在独立的TaqMan系统中检测纯合子KO小鼠（n=5）mRNA的上游和下游序列尼奥插入位置。（F）饱和RT-PCR扩增*粉红色1*包含每个剪接位点的mRNA序列，研究野生型、杂合型（ht）和纯合型（hm）小鼠的大脑和肝脏mRNA，显示纯合子组织异常，外显子4-5剪接边界有额外的大条带，外显基因5-6边界有异常大的涂片。（G）引物饱和RT-PCR粉红色1内含子5和尼奥选择标记显示内含子和尼奥中的序列*引脚1*来自突变（ht和hm）小鼠样本的mRNA。

**图2。目视检查的进展表型*粉红色1* ^−/−老鼠。**
敲除（KO）小鼠与野生型（WT）小鼠相比，显示出（A）从中年开始体重持续不断地减少，（B–F）自发运动减少，这对旷野参数（B）总距离、（C）水平活动、（D）运动时间、（E）定型计数和（F）老年时的中心距离有显著影响。

**图3。已老化*粉红色1* ^−/−大脑中多巴胺含量下降。**
HPLC分析*粉红色1* ^−/−纹状体匀浆在9个月龄和22-24个月龄时检测到多巴胺（DA）显著减少（每组n=8）。

**图4。已老化*粉红色1* ^−/−大脑没有表现出帕金森病神经退行性变的典型症状。**
（A–C）中脑组织多巴胺能神经元的体视学计数：（A）野生型（WT）酪氨酸羟化酶（TH）免疫染色和*粉红色1* ^−/−（KO）黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）（比例尺，200µm）。（B） WT（n=5）和KO（n=6）SN中TH-免疫阳性细胞的无偏体视学定量。平均神经元计数仅113个细胞不同。（C） WT（n=4）和KO（n=6）小鼠30个连续中脑切片中无偏倚取样的TH-免疫阳性SN神经元的平均数量，覆盖了尾-尾轴（bregma−3.8至−3.2）。请注意，这两个图之间没有显著差异。（D–F）背侧和腹侧纹状体多巴胺能神经末梢的光密度：（D）WT和KO小鼠纹状体切片的TH免疫染色（标尺，500µm）。（E，F）WT（n=5）和KO（n=6）小鼠背侧（DS）和腹侧纹状体（VS）TH免疫染色密度的光密度定量。背侧纹状体（平均WT 71.0，SEM 5.6；KO 66.9，SEM 2.6）和腹侧纹状体内（WT 80.6，SEM 5.4；KO 75.7，SEM 2.5）无显著差异。

**图5。线粒体前蛋白输入的进行性缺陷。**
（OTC）前体蛋白线粒体输入减少*粉红色1* ^−/−随着年龄的增长（A-C），小鼠肝线粒体（每组和每个年龄段的动物数量为2-4只）的损伤越来越严重。基质和内膜标记物人苹果酸脱氢酶（MDH）（D）和细胞色素的导入*c1级*（E）而内膜磷载体蛋白的导入量减少（P_我C）作为替代易位途径（F）的标记物，在老年动物中不受影响。

**图6。线粒体生物能量功能的进展性病理学*粉红色1* ^−/−大脑。**
基础ATP水平降低*引脚1* ^−/−分离细胞（A），（B）分离细胞和（C）分离线粒体基底膜电位Δψm的降低*粉红色1* ^−/−与野生型大脑相比，复合物I+III+IV（Cx I）和IV（Cx-IV）（D，E）的呼吸活动减少，证实了老年线粒体功能障碍。

**图7。早期应激诱导的线粒体分裂缺陷*粉红色1* ^−/−神经元。**
用Mitotracker染色的出生后原代皮层神经元培养物在无应激条件下（E）或用MG132（F）进行蛋白酶体应激后，通过定量线粒体形态类型（A=碎片，B=管状，C=长管状/网状，D=聚集）进行分析。在没有应激的情况下，野生型和野生型之间的线粒体形态没有差异*粉红色1* ^−/−神经细胞。在应激状态下，在*粉红色1* ^−/−神经元，表明在*粉红色1* ^−/−电子显微镜未能显示嵴缺失或其他明显的结构病理，如从的两个代表性切片中所示*粉红色1* ^−/−18个月大时的大脑（G，H）。来自3只21个月大的不同小鼠的线粒体内膜（复合物I–V）或外膜（孔蛋白）标记蛋白的免疫印迹未显示线粒体质量增殖或内外膜比率改变（I）。

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1. Bentivoglio AR、Cortelli P、Valent EM、Ialongo T、Ferraris A等。三个不相关意大利家族中常染色体隐性遗传PARK6连锁帕金森综合征的表型特征。Mov Disord公司。2001;16:999–1006.-公共医学
1. Nakajima A、Kataoka K、Hong M、Sakaguchi M、Huh NH。BRPK，一种新型蛋白激酶，在具有较高转移潜能的小鼠癌细胞系中表达增加。癌症快报。2003;201:195–201.-公共医学
1. Hoepken HH、Gispert S、Morales B、Wingerter O、Del Turco D等。PARK6中线粒体功能障碍、过氧化损伤和谷胱甘肽代谢变化。神经生物学疾病。2007;25:401–411.-公共医学
1. Hoepken HH、Gispert S、Azizov M、Klinkenberg M、Ricciardi F等。帕金森病患者成纤维细胞显示α-同核蛋白表达增加。实验神经学。2008;212:307–313.-公共医学

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