Up-regulation of miR-21 by HER2/neu signaling promotes cell invasion

doi:10.1074/jbc.M109.006676

.2009年7月3日；284(27):18515-24.

doi:10.1074/jbc。M109.006676。 Epub 2009年5月6日。

HER2/neu信号上调miR-21促进细胞侵袭

子玄黄¹, 吴方亭, 加布里埃尔·勒布, 鲁比·徐, 艾米·海德斯巴赫, 艾利森·布林卡特, 戴和陆（Dai Horiuchi）, 罗伯特·莱宾克, 尹元墨, 安德烈·戈加, 迈克尔·麦克马纳斯

附属公司

PMID： 19419954
PMCID公司： PMC2709372型
内政部： 10.1074/jbc。M109.006676号

HER2/neu信号上调miR-21促进细胞侵袭

子玄黄等。生物化学杂志. 2009.

.2009年7月3日；284(27):18515-24.

doi:10.1074/jbc。M109.006676。 Epub 2009年5月6日。

作者

附属

¹美国加利福尼亚州旧金山加利福尼亚大学微生物学和免疫学系94143。

PMID： 19419954
PMCID公司： PMC2709372型
内政部： 10.1074/jbc。M109.006676号

摘要

细胞表面受体酪氨酸激酶HER2/neu增强肿瘤转移。最近的研究表明，解除调控的microRNA（miRNA）表达促进癌细胞的侵袭和转移；因此，我们探讨了HER2/neu信号转导诱导参与这一过程的特异性miRNAs表达的可能性。我们发现了一种可能致癌的miRNA，miR-21，其表达与HER2/neu上调相关，并在功能上参与HER2/neu诱导的细胞侵袭。我们发现，在乳腺癌细胞中刺激HER2/neu信号传导时，miR-21通过MAPK（ERK1/2）途径上调，而其他ERK1/2激活剂如RASV12或ID-1的过表达足以在HER2/neu阴性乳腺癌细胞中诱导miR-21上调。此外，在表达HER2/neu的乳腺癌细胞中，miR-21下调了转移抑制蛋白PDCD4（程序性细胞死亡4）。我们的数据揭示了HER2/neu通过miRNA解除调控诱导癌细胞侵袭的机制。此外，我们的结果确定miR-21是预防乳腺癌侵袭和转移的潜在治疗靶点。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**HER2的异位表达/*neu（新）*诱导miR-21上调。** A类，转染neo载体的MDA-MB-435细胞(蓝线)或转染HER2的MDA-MB-435/*neu（新）*-表达载体(红线)用异硫氰酸荧光素染色(*FITC公司*)-共轭抗人HER2/*neu（新）*抗体(*左侧面板*)使用qRT-PCR评估MDA-MB-435细胞中miR-21的表达水平(*右侧面板*). 用SDS-PAGE分离细胞裂解产物，并用抗HER2/neu抗体或抗管蛋白抗体进行Western blot分析。B类、HER2/*neu（新）*不同载体转染HeLa细胞的表达。HeLa细胞系(*灰度直方图*)，转染pEBS7空载体的HeLa细胞系(虚线)或转染pEBS7-HER2的HeLa细胞系/*neu（新）*(黑线)用异硫氰酸荧光素结合抗人HER2染色/*neu（新）*抗体。用SDS-PAGE分离细胞裂解产物，并用抗HER2/neu抗体或抗管蛋白抗体进行Western blot分析。C类HER2作用的miRNA微阵列分析/*neu（新）*过度表达。来自用pEBS7和pEBS7-HER2转染的HeLa细胞的RNA/*neu（新）*用不同的荧光标记并在微阵列上竞争性杂交。散点图中的每个点代表来自两个染料交换阵列的一个microRNA探针的归一化平均荧光。D类和E类，RNA用于B类通过qRT-PCR分析miR-21的表达(D类)并在相同条件下通过Northern blot分析进行单独实验(E类). 指出了三次重复实验的平均误差和标准误差。

**图2。**
**HER2型/*neu（新）*在不同的癌细胞系中，信号传导诱导miR-21上调具有不同的动力学。**实时PCR分析HeLa-HER2中miR-21前体（pri-miR-21）和成熟miR-21表达/*neu（新）*或HeLa-vector细胞(A类)，SKBR3细胞(B类)和BT-474单元(C类)用100n刺激米HER2型/*neu（新）*不同时间点的激动剂。D类用100μm n刺激感染慢病毒的SKBR3细胞，慢病毒携带的mCherry基因在3′-非翻译区有两个互补的miR-21或miR-155结合位点（分别为mCherry-miR-21传感器或mCherri-miR-155-传感器）米HER2型/*neu（新）*激动剂作用4d，流式细胞仪检测荧光信号。指出了三次重复实验的平均误差和标准误差。

**图3。**
**HER2型/*neu（新）*通过MAPK（ERK1/2）途径调节miR-21的表达。** A类，BT-474细胞用100 n米HER2型/*neu（新）*40μ存在下的激动剂米我₂SO、LY294002或U0126。4天后，收集RNA，用qRT-PCR分析miR-21的表达。B类，BT-474细胞用100 n米HER2型/*neu（新）*5、10和40μ米U0126和miR-21的表达按照以下描述进行评估：交流、SKBR3和HeLa-HER2/*neu（新）*用100n处理细胞米HER2型/*neu（新）*我面前的激动剂₂SO或40μ米U0126和miR-21的表达按如下所述进行测定*答：D*用控制载体、野生型ERK2或显性阴性ERK2转染293T细胞。2天后，从每个样本中收集RNA，并通过实时PCR分析成熟miR-21水平。用SDS-PAGE分离细胞裂解产物，并用抗磷酸-ERK抗体或抗管蛋白抗体进行Western blot分析。将磷酸化ERK的强度与微管蛋白的强度进行标准化，以获得ERK的折叠激活。E类将编码GFP和Ets-1的表达质粒转染BT-474细胞，靶向小发夹RNA或GFP和打乱的小发夹RNA序列。7天后，分选绿色荧光阳性细胞，并通过实时PCR测定Ets-1和pri-miR-21转录水平。对照样品的值作为参考。F类从感染表达控制载体（pMIG-empty）、活化H-Ras（G12V）、活化肉豆蔻酰化AKT、Myc和ID-1-血凝素标签的重组逆转录病毒的MCF10A细胞中收集RNA。用qRT-PCR分析miR-21的表达。指出了三次重复实验的平均误差和标准误差。通过SDS-PAGE分离细胞裂解产物，并使用相应抗体（抗磷酸-AKT、抗Myc、抗血凝素标签和抗RAS）通过Western blot分析，以证明相应蛋白的过度表达。

**图4。**
**miR-21对HER2至关重要/*neu（新）*诱导癌细胞侵袭。** A类MDA-MB-435细胞被携带miR-21前体（pri-miR-21）或对照载体的慢病毒感染，并使用Matrigel transwell分析评估细胞侵袭性。B类，MDA-MB-435/HER2/*neu（新）*用miR-21抑制剂或对照抑制剂转染细胞。24小时后，通过Matrigel transwell分析评估细胞侵袭性。C类，在中*右侧面板*用同种对照抗体或Herceptin抗体处理BT-474细胞7天。在*左侧面板*，BT-474细胞用Me处理₂SO或厄洛替尼2天。qRT-PCR检测成熟miR-21的表达。D类用miR-21抑制剂或对照抑制剂转染BT-474细胞。48小时后，使用Matrigel transwell分析评估细胞侵袭。指出了三次重复实验的平均误差和标准误差。

**图5。**
**HER2型/*neu（新）*通过miR-21下调PDCD4表达。** A类，检测MDA-MB-435/HER2中PDCD4的表达/*neu（新）*和MDA-MB-435/Neo细胞。核结构蛋白层粘连蛋白A在本实验中为阳性对照。B类,*miR-21基因*下调MDA-MB-435/Neo细胞中的PDCD4。C类，抗miR-21增加了MDA-MB-435/HER2中PDCD4的水平/*neu（新）*.英寸B类和C类，首先用miR-21表达载体或羧基荧光素转染细胞(*FAM公司*)-标记抗miR-21，然后用PDCD4抗体进行免疫染色，如“实验程序”所述

**图6。**
**HER2中miR-21对细胞侵袭的调控/*neu（新）*过度表达的癌细胞。**在没有HER2过度表达的正常细胞中/*neu（新）*内源性PDCD4的水平限制了细胞的侵袭性。然而，在HER2的癌细胞中/*neu（新）*过度表达，HER2/*neu（新）*通过Ras/ERK1/2途径激活Ets-1，从而启动miR-21转录。miR-21抑制转移抑制蛋白PDCD4和/或其他未知靶点的翻译以促进HER2的侵袭性/*neu（新）*-癌细胞过度表达。

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