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.2009年4月28日；106(17):7215-20.
doi:10.1073/pnas.0810624106。 Epub 2009年4月9日。

慢病毒trkB诱导Erk活化诱导皮质脊髓再生

Edmund R Hollis第二 1, 普亚·贾姆什迪, 卡琳·洛夫, 阿明·布利希, 马克·H·图辛斯基
附属机构

慢病毒trkB诱导Erk活化诱导皮质脊髓再生

Edmund R Hollis第二等。 美国国家科学院程序. .

摘要

对中枢神经系统环境的几项实验操作成功地诱导了感觉和球脊髓运动轴突的再生，但未能诱导皮质脊髓轴突再生，这表明细胞内机制限制了这类关键运动神经元的再生。我们假设，增强固有的神经元生长机制将使成人皮质脊髓运动轴突再生。慢病毒载体用于在V层皮质脊髓运动神经元中过度表达BDNF受体trkB。皮质下轴突切断术后，trkB转导诱导皮质脊髓轴突再生到表达BDNF的皮质下病变部位。在没有trkB过度表达的情况下，没有再生发生。通过突变Shc/FRS-2激活域选择性删除trkB介导的典型神经突起生长信号，从而阻止Erk激活并消除再生。这些发现支持这样一种假设，即成年皮质脊髓轴突的难治性再生状态至少部分可归因于神经元内在机制，ERK信号的激活可引发皮质脊髓束再生。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
trkB表达促进成年DRG神经元对BDNF的反应中突起的生长。成人CGRP-免疫活性DRG神经元-d日-用慢病毒载体转导的赖氨酸。(A类)用trkB转导并在72小时内添加20 ng/mL BDNF可导致神经突起的广泛发育。(B类)仅用copGFP转导加上BDNF的加入，导致很少突起的形成。(C)在没有BDNF的情况下用trkB进行转导，几乎不会产生CGRP免疫活性神经元的突起。(D类)Sholl分析表明，trkB转导的CGRP的神经突起乔木复杂性显著增加+BDNF刺激的DRG神经元（重复测量ANOVAP（P）< 0.05). (电子)在trkB转导的CGRP中，最长神经突起的平均长度显著增加+神经元在20 ng/mL BDNF的存在下。(F类)抑制trkB激活下游的细胞生存途径（PI3K，Akt）并不影响trkB转导、BDNF刺激、CGRP中的突起生长+DRG神经元。相反，抑制Erk可消除所有过程扩展。*，方差分析P（P）< 0.05; **, χ2 P（P）<0.05。（比例尺：A–C，100微米；插图，25微米）
图2。
图2。
trkB在体内诱导轴突再生。(A类)共聚焦图像堆栈显示细胞体中HA免疫标记的trkB转基因产物和慢病毒转导的V层锥体细胞的过程。(B类)载体注射导致copGFP报告基因在V层运动皮层中表达，该运动皮层位于皮质下抽吸损伤的背侧，该损伤已与BDNF分泌的成纤维细胞移植。(C)运动皮层载体注射部位HA免疫标记。虚线表示靶向皮质脊髓神经元体所在的V层皮层。CC表示胼胝体。(D类和电子)将HA标记的trkB受体贩运到皮层下白质轴突的示例（采样区域如图所示C). (F–H（飞行高度）)GAP-43和copGFP的双重标记表明，慢标记B-copGFP-转导的皮质轴突在损伤部位再生为BDNF-分泌移植物。未接受trkB载体注射的受试者中不存在轴突（见图3-6）。(I–K型)V层皮质轴突标志物SMI-32和copGFP的双标记也表明在注射低分子量B和皮质下移植BDNF分泌细胞后轴突再生。(左旋-右旋)5-羟色胺能轴突也能独立于trkB感染而再生为分泌BDNF的细胞移植物。（比例尺：A类和I–N型，10微米；B类和C500微米；D类和电子，25微米；F–H（飞行高度），5μm）
图3。
图3。
trkB在体内诱导轴突再生。(A–C)重链神经丝（NF200）标记和(D–F型)非磷酸化神经丝（SMI-32）标记是V层锥体神经元的标记，与对照病毒注射相比，皮质trkB病毒注射后，BDNF表达移植物的轴突再生增加。虚线表示宿主-移植物界面。(C和F类)BDNF-分泌纤维母细胞移植物中NF200免疫标记和SMI-32免疫标记轴突的定量显示出显著的组间差异（*，Wilcoxonχ2 P（P）< 0.002). (G–I型)trkB过度表达后，抑制性小白蛋白免疫反应中间神经元在BDNF-分泌移植物中的生长也增加（*，Wilcoxonχ2 P（P）< 0.002). (J–L型)正如预期的那样，从投射到等皮质的非转导的5-羟色胺能纤维中未观察到5-羟色酮能纤维渗透性的差异。（比例尺：25μm）
图4。
图4。
trkB转导、鉴定的皮质脊髓轴突再生为BDNF分泌移植物。(A类)在C3脊髓内注射自我互补的AAV6-eGFP可导致V层锥体运动神经元中eGFP的表达。(B–D类)通过eGFP表达鉴定的逆行性scAAV6感染的皮质脊髓运动神经元，在注射了lent-trkB-copGFP的动物中与免疫上不同的copGFP报告基因共存。(E–G公司)共聚焦图像显示，在慢标记B-copGFP转导后，BDNF-分泌型移植物内有eGFP-免疫反应性皮质脊髓轴突与copGFP-共标记。在未注射trkB构建物的受试者的皮质下移植物中未检测到copGFP标记的轴突。(H（H）)逆转录GFP标记的皮质脊髓神经元延伸的另一个例子(我)eGFP免疫反应轴突（箭头）进入BDNF分泌的皮质下移植物；宿主-移植物界面用虚线表示。(J型)BDNF分泌皮质下移植物中eGFP免疫反应轴突轮廓的定量。当转导trkB（*，Wilcoxonχ2 P（P）< 0.002). (K（K）)在scAAV6-eGFP注射前1周，将EtBr注射到C3背索，可提高eGFP（*，2-尾）对皮质脊髓运动神经元的逆行标记效率t吨测试P（P）< 0.01). (L（左）)在背柱注射EtBr增强逆行感染后皮质注射lent-trkB-copGFP后，BDNF-分泌细胞移植物中eGFP标记轴突轮廓的定量（*，Wilcoxonχ2 P（P）< 0.0002). （比例尺：B–D类和我，25微米；E–G公司，5微米；H（H），50微米）
图5。
图5。
皮质脊髓轴突再生为BDNF分泌移植物。(A类)将EtBr注入脊髓，将scAAV6-eGFP注入脱髓鞘的背柱，并将lent-trkB-copGFP注入运动皮层，对受试者的V层皮质脊髓运动神经元（箭头所示）进行逆行标记。皮质运动神经元胞体中表达的eGFP载体充满轴突，可以明确识别再生为BDNF分泌细胞移植物的皮质脊髓轴突。虚线表示宿主与皮质下病变/移植物部位的界面。(B类)在接受皮内注射慢copGFP的对照受试者中，scAAV6-eGFP对皮层神经元的逆行标记效率也有所提高。(C–E类)更高放大率的装箱区域A类在一个小剂量B注射的受试者中，说明(C)逆行标记的皮质脊髓神经元胞体(D类)皮质下病变腔中靠近BDNF分泌细胞移植物的轴突，以及(电子)BDNF移植物内轴突再生。(F类)在未接受慢标记B注射的对照组中，受损的皮质脊髓轴突（箭头）与损伤腔内的BDNF分泌细胞移植物邻接，但未穿透移植物。(G公司)另一个受试者的皮质脊髓运动神经元逆行标记AAV6-eGFP（箭头）的例子，该受试者也接受了皮质脊髓皮质内的慢标记B-copGFP注射，并且这些神经元的轴突再生为BDNF-分泌移植物[用神经清质追踪（红色）]。其中一个轴突（方框）的放大倍数如所示H（H）. (I–K型)GFP标记的轴突在BDNF-分泌型移植物中再生的其他示例，这些受试者也接受了运动皮层的小剂量B注射：(我和J型)再生轴突具有三分叉的头部，类似于张开的生长锥，以及(K（K）)BDNF移植物中与血管（*）相关的轴突（箭头）。血管系统是层粘蛋白的来源，层粘蛋白是一种细胞粘附分子，通常允许轴突生长。方框区域的放大倍率如所示J型。（比例尺：A类和G公司500微米；B类，100微米；C和D类，50微米；电子,F类、和H–K型，25微米）
图6。
图6。
BDNF介导的再生依赖于酪氨酸515磷酸化。为了研究trkB在体外诱导轴突生长的潜在机制，研究了trk信号结构域的选择性突变的影响。通过选择性删除Shc/FRS-2激活位点中的酪氨酸515消除Erk激活，消除BDNF诱导的Erk磷酸化，减少神经突起生长。(A–C)转染表达trkB的PC12细胞在对NGF的反应中表现出突起生长(B类)或BDNF(C). （比例尺：100μm）(D类)BDNF刺激8天后的定量显示，trkB转基因介导的神经突起生长需要酪氨酸515（Y515）。全长trkB的表达显著促进神经突起生长（ANOVAP（P）< 0.0001; *, 事后费希尔P（P）< 0.0001). trkB中酪氨酸515磷酸化位点的缺失Y515F型和trkBY515F+PI3K型各组在BDNF存在时几乎消除了神经突起的生长。酪氨酸515完整但PLC-γ激活位点Y816突变的突变trkB的表达（trkBΔKFG-Y816F与缺乏酪氨酸515（**，P（P）< 0.01). (电子)在FACS纯化、慢病毒转导的PC12细胞中，刺激trkB的BDNF激活神经突起生长（Shc、FRS2、PLC-γ、Erk1/2和CREB）和细胞存活（Akt）的下游效应器。(F类)经CASE检测，刺激BDNF 40分钟（50 ng/mL）后PC12细胞中的Erk磷酸化表明在典型的神经突起生长信号级联中需要Y515激活Erk。与对照组、未刺激PC12细胞相比，BDNF暴露仅在转导表达trkB的PC12细胞中产生显著水平的Erk磷酸化，Y515完整（方差分析P（P）< 0.05; *, 事后费希尔P（P）< 0.05). 为了研究trkB诱导再生的机制，在体内检测了trk信号结构域的选择性突变的影响。(G–J型)Lent-trkB介导的再生需要完整的酪氨酸515，因为对照组转导copGFP的受试者和转导表达trkB但缺乏Shc/FRS-2激活位点的受试对象在BDNF-分泌的皮层下移植物中同样缺乏NF200-免疫活性轴突，而NF200-免疫活性轴突在转导表达全长trkB和trkB的受试者中大量存在，缺乏PLC-γ活化位点Y816，但具有完整的Y515 Shc/FRS-2活化位点。(K（K）)量化揭示了酪氨酸515磷酸化在成人中枢神经系统损伤后轴突再生中的本质（ANOVAP（P）< 0.0001; *, 事后费希尔P（P）< 0.01). （比例尺：5μm）
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