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.2009年4月6日；185(1):11-9.
doi:10.1083/jcb.200807195。 Epub 2009年3月30日。

蛋白酶依赖性与非依赖性癌细胞侵袭程序：三维变形虫运动的回顾

法里德·萨贝赫 1, 清水平田良子, 史蒂芬·J·维斯
附属公司

蛋白酶依赖性与非依赖性癌细胞侵袭程序：三维变形虫运动再探

法里德·萨贝赫等。 J细胞生物学. .

摘要

转移过程中的组织侵袭需要癌细胞通过由I型胶原交联网络主导的基质环境。虽然已知癌细胞使用蛋白酶来切断胶原网络，从而使其通过这些屏障更容易，但也有报道称，通过蛋白酶依赖性机制，细胞通过阿米巴样表型挤压胶原蛋白衬里的孔，从而发生细胞外基质的迁移。我们研究了这些运动的替代模型，并证明癌细胞对膜锚定金属蛋白酶MT1-MMP的侵袭有绝对需求，只有当胶原蛋白网络缺乏正常组织所特有的共价交联时，细胞迁移的蛋白酶依赖性机制才可能成立。

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数字

无
3D癌细胞侵袭。将HT-1080纤维肉瘤细胞的多细胞球体包埋在天然I型胶原的3D凝胶中3天。将凝胶固定在2%戊二醛/1.5%多聚甲醛的0.1 M二羧酸钠缓冲液中，冷冻破碎，并进行扫描电镜处理。使用XStream成像软件对浸润细胞和周围ECM的图像进行数字成像。SASHA MESHINCHI公司
图1。
图1。
MT1-MMP对3D I型胶原中癌细胞侵袭表型的调节。（A） 使用对照siRNA、MMP-1和MMP-2 siRNA、MT1 siRNA（50–100 nM；siRNA序列可在Li等人[2008]和Sabeh等人[2004]中找到）电穿孔后，在悬浮液滴中制备HT-1080细胞或MDA-MB-231细胞的Di-I标记多细胞球体（直径150–200µm），或与MT1 siRNA和小鼠（m）MT1-MMP或对照表达载体共转染（在PCR3.1 Uni中各0.5µg；m.Seiki的礼物，东京大学，日本；Sabeh等人，2004年；Li等人，2008年），并包埋在3D I型胶原凝胶中（如前所述由大鼠尾腱的酸提取物制备[Sabeh等人，2004]并通过SEM在左侧面板上的上角插图进行可视化；bar=5µm），在没有或存在10µm GM6001的情况下，最终浓度为2.2 mg/ml。0d（面板顶行）时通过荧光显微镜监测侵袭，3d后通过共焦显微镜监测Alexa-488卵磷脂和DAPI（面板底行；Di-I，红色；Alexa-488-卵磷脂，绿色；DAPI，蓝色）染色。对于MDA-MB-231电池（面板底部一行），插图中显示了0 d处的球体。棒材=100µm。（B） 如RT-PCR所示，MT1-MMP、MMP-1和MMP-2 siRNA抑制HT-1080细胞中靶向MMPs的表达，但对非靶向MMP的表达没有影响。（C） 在HT-1080、MDA-MB-231或SUM-159细胞的第1天和第3天分别监测从接种部位到周围基质的侵入距离（如前所述进行量化；[Hotary等人，2000；Sabeh等人，2004]）。在存在针对丝氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和基质金属蛋白酶的蛋白酶抑制剂混合物的情况下（Wolf等人，2003a），HT-1080的侵袭被抑制99±0%。结果表示为平均值±SEM(n个= 4). （D） 将HT-1080细胞球体嵌入I型胶原蛋白凝胶中，在没有或存在指定剂量的BB-2516的情况下放置3天。插图显示了Di-I标记后0天的球体，以及3天后细胞的迁移情况，如相关面板的最下面一行所示。棒材=100µm。在40、100和500 ng/ml（1.5µM）BB-2516下，侵袭抑制率分别为59±4%、86±2%和99±0%。
图2。
图2。
MT1-MMP–非依赖性肿瘤细胞通过端肽激发或交联缺失的I型胶原凝胶侵袭。（A） I型胶原分子间交联示意图。在体内，赖氨酰氧化酶在I型胶原蛋白的N端和C端端肽结构域内生成醛基部分，这些醛基从ϵ氨基（盒状区域）排列而成，在体内自发浓缩以形成席夫碱、醛亚胺交联。在胃蛋白酶提取过程中，N端和C端端肽被去除（箭头所示）。在酸性萃取条件下，希夫碱的形成被逆转，生成起始醛基和胺基。用硼氢化钠处理后，醛转化为不再支持交联形成的醇。（B） 用对照或MT1 siRNA电穿孔的HT-1080细胞的Di-I-标记的多细胞球体包埋在由胃蛋白酶提取的牛真皮（玻璃质；2.2mg/ml）或胃蛋白酶提取的大鼠尾腱制备的3D凝胶中，并在0天（图的顶行）和1天后（图的第二行）通过荧光显微镜监测；Di-I，红色；Alexa-488卵磷脂，绿色；DAPI，蓝色）。胃蛋白酶提取胶原蛋白凝胶的SEM显示在用对照siRNA电穿孔的0-d球体的插图中（第一行左侧面板；bar=5µm）。在0 d时将GM6001（10µM）添加到面板右侧列中的培养物中。棒材，100µm。在面板的最下面一行，Di-I标记的HT-1080球体在0天（插图）嵌入硼氢化物还原的鼠尾I型胶原凝胶（2.2 mg/ml）中，并在用对照siRNA、MT1-MMP siRNA电穿孔后1天或在GM6001存在下培养后监测入侵。用分光光度法测定硼氢化物还原前后的胶原蛋白醛含量（Williams等人，1978；Gelman等人，1979）。在1d培养期后，用Alexa-488卵磷脂和DAPI对细胞进行染色，如上所述。棒材，100µm。（C） HT-1080或MDA-MB-231球状体在3D胃蛋白酶化或减少的I型胶原中培养1d，并量化其侵入周围基质的距离。在蛋白酶抑制剂混合物（Wolf等人，2003a）存在下，胃蛋白酶化或还原胶原蛋白凝胶中的HT-1080侵袭分别被抑制0±0%和8±1%。结果表示为平均值±SEM(n个= 4). 酸提取、胃蛋白酶提取和减少的胶原蛋白纤维同样具有胰蛋白酶抗性（未描述）。
图3。
图3。
MT1-MMP促进人类乳腺外植体中的癌细胞侵袭。（A） 将MDA-MB-231 Di-I标记的球体（由与对照siRNA、MT1-MMP siRNA或MT1-MMP-siRNA一起电穿孔的细胞和小鼠MT1-MMPsiRNA表达载体组成）注射到人类乳腺外植体（6×8×6mm）中（30号针头），并在0 d通过荧光显微镜记录癌细胞聚集物的位置。棒材=20µm。插图显示乳腺外植体中I型胶原纤维的SEM。棒材=5µm。接种的外植体随后在活鸡CAM上培养3天。用Alexa-488和DAPI标记乳腺组织后，用荧光显微镜监测MDA-MB-231细胞的侵袭行为。棒材=200µm。第3天乳腺组织横截面的免疫荧光染色（插入物）显示了用单克隆抗体HU177检测到的变性胶原束（Hotary等人，2003；Sabeh等人，2004）（绿色；箭头）围绕侵袭性肿瘤细胞（红色），而不是MT1-MMP沉默的癌细胞（底部面板；bar=10µm）。（B） 如前所述，在人类乳腺外植体中进行三维培养后，量化MDA-MB-231或SUM-159球体（用对照siRNA、MMP-1和MMP-2 siRNA、MT1-MMP siRNA或MT1-MMP-siRNA结合小鼠MT1-MMPexpression vector电穿孔）的侵入距离。结果表示为平均值±SEM(n个= 3). （C） 如前所述，在小鼠乳腺外植体中进行三维培养后，量化MDA-MB-231或SUM-159球体（用对照siRNA、MMP-1和MMP-2 siRNA、MT1-MMP siRNA或MT1-MMP-siRNA结合小鼠MT1-MMPexpression vector电穿孔）的侵入距离。结果表示为平均值±SEM(n个= 3).
图4。
图4。
癌细胞对白细胞的胶原蛋白无侵袭性和降解活性。HT-1080或人类PMN（Huber和Weiss，1989）分别制备3天或1天的I型胶原凝胶（2.2 mg/ml）横截面的显微照片。胶原蛋白非侵袭性细胞被H&E染色并用黑色箭头标记。双头箭头标记了下面胶原蛋白凝胶的边界。黑条=100µm。在罗丹明标记的I型胶原的3D凝胶上培养3天的HT-1080细胞的激光共聚焦显微照片表明，侵袭与界限清晰的隧道的形成有关（白色箭头；白色条=50µm）。相反，用酵母多糖活化血浆刺激的PMN（Huber和Weiss，1989）侵入罗丹明标记的胶原蛋白凝胶，而不干扰基质结构（最右侧面板）。如前所述，在BB-2516（1.5µM）不存在或存在的情况下，对HT-1080、PMN、T细胞和单核细胞的侵袭和胶原蛋白降解活性进行了量化（条形图，底部面板）（Sabeh等人，2004）。在存在如所述制备的蛋白酶抑制剂混合物的情况下，也对PMN侵袭进行了评估（Wolf等人，2003a）。结果表示为平均值±SEM(n个= 4). （B） 如前所述，在pH 5.5、6.5、7.5和8.5的条件下制备酸提取的大鼠尾胶原蛋白凝胶（Raub等人，2008），并在三维培养期后，在不存在或存在BB-2516（1.5µM）的情况下量化HT-1080细胞对3D凝胶的侵袭活性。插图中显示了SEM显示的pH值为5.5和8.5的胶原蛋白(n个= 3; bar=250 nm）。
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