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.2009年3月20日；136(6):1122-35.
doi:10.1016/j.cell.2008.12.043。

Ezh2调控组织特异性干细胞逐步分化的基因表达

埃琳娜·埃日科娃 1, H阿马利亚·帕索利, 乔尔·帕克, 妮可·斯托克斯, 素宜新, 格雷戈里·汉农, 亚历山大·塔拉霍夫斯基, 福克斯
附属公司

Ezh2调控组织特异性干细胞逐步分化的基因表达

埃琳娜·埃日科娃等。 单元格. .

摘要

尽管对胚胎干细胞的体外研究已确定多梳阻遏物复合体（PRCs）是分化的关键调节器，但PRC介导的机制如何控制发育组织中多能干祖细胞的命运尚不清楚。这里，我们发现一种重要的PRC成分Ezh2在表皮祖细胞中表达，但随着胚胎分化和出生后增殖活性的下降而减少。我们发现，Ezh2通过抑制Ink4A-Ink4B基因座来控制基础祖细胞的增殖潜能，并通过防止AP1转录激活物过早募集到表皮分化所需的结构基因来减缓分化的发展速度。总之，我们的研究表明，PRC在时间和空间上控制组织限制性干细胞中的表观遗传修饰。它们保持其增殖潜力，在全球范围内抑制不良分化程序，同时有选择地逐步建立特定的终末分化程序。

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数字

图1
图1。Ezh2标记表皮发育中的基底细胞祖细胞
（A） E14表皮PcG组分的差异表达。FACS纯化的基底细胞和基底上细胞通过其分离的mRNA的半定量RT-PCR进行分析。数据为平均值±标准偏差。n=3*p<0.05。（B–F）基础Ezh2的年龄相关性下降与增殖潜能降低相关。在处死小鼠前4小时给予BrdU。冷冻皮肤切片进行免疫荧光显微镜检查。初级抗体根据次级抗体进行颜色编码。细胞核用Dapi（蓝色）染色。（G） 半定量RT-PCR显示PcG组分的表达在体外随着表皮末端分化而降低。底漆高效放射治疗用于归一化。数据为平均值±标准偏差。n=2*p<0.05。（H） Ezh2蛋白在体外钙诱导MK分化时减少。对照是肌动蛋白（不变）和K10（棘突标记物）。（I–J）免疫荧光和western blot分析显示Ezh2核定位和分配。注意，根据H3判断，细胞溶质部分（C）含有少量残余核物质，而根据缺乏β-微管蛋白判断，核部分（N）是干净的。B、 基础。SB，基底上。真皮，真皮。HF，毛囊。β4，β4整合素标尺，30µm。
图2
图2。在胚胎基底祖细胞中，triMeK27-H3标记了表皮和非表皮谱系的沉默分化特异基因
（A和C）ChIP分析显示，在FACS纯化的E16基底祖细胞中，三MeK27-H3和体H3与非表皮和表皮基因启动子的关联。基底的半定量PCRK5公司基因启动子区用于标准化。数据为平均值±标准偏差。n=2。（B和D）E16基底细胞（BL）中的非表皮和表皮mRNAs相对于P0胚胎的全表皮的RT-PCR。阴性对照是以总RNA（−RT）为模板的PCR。从骨骼肌和大脑中分离出RNA的RT-PCR作为Myod1（肌肉）和Olig2（大脑）的阳性对照（+Cont）。控制为HPRT（不变）。
图3
图3。Ezh2在表皮祖细胞增殖潜能中的发育作用
（A–C）免疫荧光和western blot显示P0中Ezh2和triMeK27-H3的缺失鄂尔多斯2cKO基底细胞。（D和E）免疫荧光显示Ki67和BrdU（+）基底细胞减少，P0.05鄂尔多斯2cKO表皮。（F） 在指定时间接受4小时BrdU脉冲的小鼠的BrdU（+）基底细胞定量。数据为平均值±标准偏差，cKO n=3–6*p<0.05。（G–J）野生型与野生型在形态、生长速率和细胞周期方面的差异，但不包括凋亡（活性胱天蛋白酶3，Ac-Cas3）鄂尔多斯2体外培养cKO表皮细胞。细胞周期数据为平均值±SD。WT，cKO n=3*p<0.05。（K–L）半定量RT-PCR测量墨水4A和/或墨水4B在体内FACS纯化的基底细胞（K）或体外培养的1°MK（L）中表达。数据为平均值±标准差。体内分析n=2，体外分析n=3*p<0.05。为了进行比较，通过分析总表皮mRNA来测定分化细胞中WT的表达高效放射治疗该基因用于所有正常化。MK，小鼠角质形成细胞。F、 馈线。比例尺，30µm。
图4
图4。Ezh2在皮肤发育过程中调节时间分化和表皮屏障获得中的作用
（A–F）组织学和免疫荧光显微镜显示P0和E16的表皮分化加速鄂尔多斯2cKO表皮。（A）和（D）中的半薄切片为甲苯胺蓝染色。冰冻切片按指示贴上抗体标签（根据次级抗体进行颜色编码）。（G） 超微结构分析。请注意，有成熟的透明角质颗粒（KG）、薄层角质层（SC）和部分周皮缺失（P）鄂尔多斯2cKO E16表皮，均缺乏WT对应物。（H） 蓝色染料排除试验用于测量皮肤屏障。Lor、Loricrin、Flg、filaggrin、BL、基底层。Sp，棘层。Gr，颗粒层。真皮，真皮。比例尺，30µm。
图5
图5。转录谱和染色质分析显示，晚期分化基因是胚胎基底细胞Ezh2抑制的直接功能靶点
（A和B）根据E16基础祖细胞微阵列数据的聚类分析得出的热图显示，在没有Ezh2的情况下，其表达通常与晚期终末分化相关的基因升高。E18 WT表皮被用作晚期终末分化活跃基因的比较来源。每个样品的微阵列杂交重复进行，并显示为单独的列。选择了在两种情况下（两种KO中的P或两种WT中的P）都表现出2对数变化（在任一方向上）和存在（“P”）的问题。红色，过度表达的基因。绿色，表达不足的基因。当Ezh2缺失时，关键表皮转录调控因子的基础表达没有明显变化（B）。（C） FACS纯化的E16基底祖细胞mRNA的半定量RT-PCR证实了当Ezh2缺失时晚期分化基因的早熟诱导。半定量RT-PCR与针对高效放射治疗基因用于归一化。数据为平均值±标准偏差。n=2*p<0.05。（D） 小鼠3号染色体上表皮分化簇（EDC）的示意图。在Ezh2缺乏的基底细胞中上调的晚期分化EDC基因标记为红色鄂尔多斯2cKO细胞。活性启动子引物半定量PCRK5公司基因用于归一化。数据为平均值±标准偏差。n=2*p<0.05。
图6
图6。转录激活剂AP1调控Ezh2 cKO基底细胞EDC基因的上调，而不是激活组蛋白修饰
（A） ChIP分析表明，在EDC沉默的WT胚胎基底细胞中，活性triMeK4-H3标记与EDC基因没有关联。使用针对5号染色体上基因间区域的引物进行半定量PCR以进行归一化。基础K5公司基因作为阳性对照。数据为平均值±标准偏差。n=2。（B） 在EDC基因的启动子处发现AP1共有位点。（C和D）半定量RT-PCR和western blotting检测表皮和培养的MK中的Jun和Fos AP1蛋白。一些成员在终末分化细胞中的表达增强。阳性对照为HPRT（不变）和Flg（分化层）。数据为平均值±标准偏差。n=2*p<0.05。（E和F）半定量RT-PCR显示EDC基因的早熟激活鄂尔多斯2cKO基础祖细胞主要被AP1抑制剂TanIIA或RNAi介导的cJun/JunD表达减弱所消除。数据为平均值±标准偏差。n=2*p<0.05。（G和H）相比之下，PMA促进AP1活性，增强EDC基因在鄂尔多斯2cKO，但不包括WT基底细胞（G）。经PMA处理的EDC上调鄂尔多斯2当Jun和JunD被敲除时，空细胞显著低于sh对照组（H）。数据为平均值±标准差。n=3*p<0.05。活动K14号公路和Ppib公司基因作为对照。BL，基底层细胞。低钙，体外条件下阻止基础祖细胞分化。高钙，促进终末分化的条件。
图7
图7。PcG抑制因子和AP1转录激活因子在表皮发育和分化中的对立作用
（A和B）半定量RT-PCR表明，当WT基底细胞致力于最终分化时，EDC基因被诱导（A），而ChIP分析（B）表明，与基底细胞中EDC基因相关的triMeK27-H3标记在钙诱导分化时下降。活性启动子引物半定量PCRK5公司基因用于标准化（B）。（C和D）ChIP分析显示，在cKO基底细胞或WT细胞分化（C）时去除Ezh2依赖的triMeK27-H3标记后，cJun招募到晚期分化基因的启动子，但在用AP1抑制剂TanIIA（D）处理细胞时，这种招募被抑制。cJun出席K5公司启动子作为阳性对照。没有招募cJun到Myod1型和奥利格3检测到缺乏明显AP1位点的启动子。使用针对5号染色体上基因间区域的引物进行半定量PCR以进行归一化。数据为平均值±标准偏差。n=2*p<0.05。（E） PcG阻遏物和Ap1激活物的差异表达确保了表皮分化的时空程序。在WT基础细胞中，triM3K27-H3标记的存在阻止AP1结合和激活后分化基因。在Ezh2cKO或分化的WT细胞中，triMeK27-H3标记的丢失允许Ap1结合并激活晚期分化基因的转录。
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中的注释

  • 皮肤下的多梳压迫。
    皮罗塔五世。 皮罗塔五世。 单元格。2009年3月20日；136(6):992-4. doi:10.1016/j.cell.2009.03.004。 单元格。2009 PMID：19303840

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