The human GINS complex associates with Cdc45 and MCM and is essential for DNA replication

doi:10.1093/nar/gkp065

.2009年4月；37(7):2087-95.

doi:10.1093/nar/gkp065。 Epub 2009年2月17日。

人类GINS复合体与Cdc45和MCM相关，对DNA复制至关重要

托马斯·阿帕里西奥¹, 艾曼纽尔·吉卢（Emmanuelle Guillou）, 哈维尔·科罗马, 吉列尔莫·蒙托亚, 胡安·门德斯

附属公司

PMID： 19223333
预防性维修识别码：项目经理2673421
内政部： 10.1093/nar/gkp065

人类GINS复合体与Cdc45和MCM相关，对DNA复制至关重要

托马斯·阿帕里西奥等。核酸研究. 2009年4月.

.2009年4月；37(7):2087-95.

doi:10.1093/nar/gkp065。 Epub 2009年2月17日。

作者

托马斯·阿帕里西奥¹, 艾曼纽尔·吉卢（Emmanuelle Guillou）, 哈维尔·科罗马, 吉列尔莫·蒙托亚, 胡安·门德斯

附属

¹DNA复制小组，分子肿瘤学项目，西班牙国家癌症研究中心（CNIO），西班牙马德里。

PMID： 19223333
预防性维修识别码：项目经理2673421
内政部： 10.1093/nar/gkp065

摘要

GINS复合物最初在酿酒酵母和非洲爪蟾中发现，在S期开始前不久与DNA复制源结合，并在开始后随复制叉移动。在这项研究中，我们对人类GINS（hGINS）同源物进行了详细的表征。使用新的抗体检测细胞和组织中的内源性hGINS，我们检测了其表达、丰度、亚细胞定位以及与其他DNA复制蛋白的关联。hGINS的表达仅限于活跃增殖的细胞。在S期，hGINS成为组装在染色质上的Cdc45 MCM GINS（CMG）复合物的一部分。hGINS的下调使CMG不稳定，导致G1-S阻滞，减缓DNA复制，有效阻止细胞增殖。我们的数据支持hGINS是人类复制子体的重要组成部分的观点。

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数字

**图1。**
细胞和组织中内源性hGINS的免疫检测。(A类)纯化重组hGINS复合物的考马斯染色。(B类)用所示抗体对293T全细胞提取物中的hGINS亚单位进行免疫印迹检测。(C类)HeLa全细胞提取物中内源性hGINS复合物的IP。用对照IgG或抗Psf2单克隆抗体免疫印迹检测IPs后的Sld5、Psf1、Psf2和Psf3。输入通道包含每个IP中使用的提取量的2%。FT，流量（每个IP中使用量的2%）。星号表示与IgG轻链的交叉反应。(D类)在用对照或*PSF2型*siRNA分子。棒材，20µm。(E类)人扁桃体活检中Psf1和Mcm3蛋白的免疫组织化学检测。棕色过氧化物酶染色显示目标蛋白的存在。虚线表示扁桃体增殖淋巴细胞的生发中心。

**图2。**
hGINS表达与增殖有关。(A类)不同细胞系中hGINS的丰度。免疫印迹法检测每个细胞系50000个细胞制备的全细胞提取物中的Psf1。重组GINS的指示量用作参考。GAPDH水平显示为负载控制。(B类)免疫印迹法检测非同步增殖（A）、静止（G0）和重新镀膜（R）BJ-hTERT成纤维细胞中的hGINS亚单位和指示蛋白。

**图3。**
hGINS对细胞增殖至关重要。(A类)转染对照组或每个亚单位的两个独立（a/b）siRNA寡核苷酸72小时后制备的HeLa细胞提取物中hGINS亚单位的免疫印迹检测。加载不同量的对照HeLa细胞提取物作为标准。α-管蛋白显示为负载控制。(B类)hGINS下调后的增殖曲线。在指定的时间点收集用对照或hGINS siRNA转染的HeLa细胞以测量细胞密度。曲线表示三个独立实验的平均值。

**图4。**
hGINS是启动和延长DNA复制所必需的。(A类)EdU掺入分析。HeLa细胞，转染对照，*SLD5型*或*PSF1系列*用EdU标记siRNAs 10分钟。Psf2通过间接IF（绿色）显示，EdU病灶通过烷基肼反应显示（红色），DNA通过DAPI染色显示（灰色）。作为阴性对照，在EdU脉冲之前用4 mM羟基脲（HU）处理细胞4小时。棒材，50µm。(B类)流式细胞术检测BrdU掺入。转染有所示siRNAs的HeLa细胞在固定前用BrdU标记60分钟。BrdU强度以对数表示年-轴和线性DNA含量x个-轴。Gates定义了G1、G1/S、S（BrdU阳性）和G2/M中细胞的百分比。对未标记BrdU的对照细胞群进行了类似分析。(C类)S期进展分析。对照处理的细胞，*SLD5型*或*PSF1系列*siRNAs在G1/S转换时同步，并在指定的时间内释放。通过流式细胞术分析DNA含量监测S期进展。

**图5。**
hGINS与染色质上的MCM和CDC45蛋白相关。(A类)hGINS在S期与染色质结合。通过免疫印迹法检测在细胞周期不同阶段同步的细胞的全细胞提取物（WCE）、可溶性组分和染色质组分中的指示蛋白。显示了同步部分的DNA含量。细胞溶质激酶Mek2和染色质相关蛋白Orc2是亚细胞分离方案的控制因素。(B类)检测人体CMG复合体。在同步于S期的HeLa细胞的可溶性（细胞质/提取的核质）提取物或核酸处理的染色质提取物中进行带有对照或Mcm3抗体的IP。通过免疫印迹检测所指示的蛋白质。输入量占IP中使用的提取物量的0.6%。

**图6。**
hGINS对于CMG复合物的稳定性是必需的。(A类)实验设计。(B类)免疫印迹法检测用对照或hPsf1 siRNA处理的细胞在IP后用抗T7抗体检测CMG复合物的成分。输入和FT（流经）通道含有IP中所用提取物的5%。条形图表示所示蛋白质的“相对IP效率”。每种情况下的绝对IP效率都是以免疫沉淀中检测到的蛋白质量与输入总量之间的比率来计算的。对于给定的蛋白质，“相对IP效率”估计为用Psf1 siRNA处理的细胞与对照细胞的IP效率之比。

**图7。**
复制叉处的hGINS模型。hGINS四聚体是CMG DNA解旋酶的一部分，可能在MCM六聚体和Cdc45单体之间起到分子桥的作用，并稳定它们的相互作用。hGINS也可能在DNA解旋过程中与ssDNA相互作用。同时，它可能有助于作用于滞后链的DNA聚合酶α/引物的募集和/或功能。详见正文。

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