Evidence that alpha-synuclein does not inhibit phospholipase D

doi:10.1021/bi801871h

比较研究

.2009年2月10日；48(5):1077-83.

doi:10.1021/bi801871h。

α-同核蛋白不抑制磷脂酶D的证据

艾丽特·拉普雷¹, 亚伦·D·吉特勒, 佩奇·E·塞尔维, 马修·杰·拉沃伊, 布鲁斯·德·利维, H亚历克斯·布朗, 苏珊·林德奎斯特, 丹尼斯·J·塞尔科

附属公司

PMID： 19146388
PMCID公司：项目经理2683767
内政部： 10.1021/bi801871小时

比较研究

α-同核蛋白不抑制磷脂酶D的证据

Irit Rappley公司等。生物化学. 2009.

.2009年2月10日；48(5):1077-83.

doi:10.1021/bi801871h。

作者

艾丽特·拉普雷¹, 亚伦·D·吉特勒, 佩奇·E·塞尔维, 马修·杰·拉沃伊, 布鲁斯·德·利维, H亚历克斯·布朗, 苏珊·林德奎斯特, 丹尼斯·J·塞尔科

附属

¹美国马萨诸塞州波士顿市哈佛医学院和布里格姆女子医院神经病学系，邮编02115。

PMID： 19146388
PMCID公司：项目经理2683767
内政部： 10.1021/bi801871小时

摘要

Alpha-synuclein（alphaSyn）是一种功能未知的小细胞溶质蛋白，在大脑中高度富集。它与帕金森病（PD）有遗传联系，因为编码alphaSyn的基因的错义突变或增殖会导致早发家族性PD。此外，散发性和家族性PD、路易体和路易神经节的神经病理学特征都包含alphaSyn-不溶性聚集体。一些研究报告表明，alphaSyn可以抑制磷脂酶D（PLD），后者水解磷脂酰胆碱形成磷脂酸和胆碱。尽管存在关于alphaSyn在健康和疾病中的作用的各种假设，但迄今为止还没有关于这种蛋白质的其他特定生化功能的报道。由于PLD抑制可能代表alphaSyn的一个重要功能，我们试图扩展关于这种相互作用的现有报告。使用纯化蛋白，我们测试了αSyn在无细胞分析中抑制PLD活性的能力。我们还检测了一些细胞系和转染条件，以评估alphaSyn是否抑制培养哺乳动物细胞中内源性或过度表达的PLD。在酵母中，我们扩展了之前关于alphaSyn和PLD依赖性表型之间相互作用的报告，PLD活性是绝对必要的。尽管测试了一系列实验条件，包括之前发布的条件，但我们在这些系统中均未观察到alphaSyn对PLD的显著抑制。我们认为，先前报道的alphaSyn对PLD活性的影响可能是由于与细胞中alphaSync过度表达相关的内质网相关应激增加所致，但不太可能是由于alphaSyn和PLD之间的特定直接相互作用所致。

PubMed免责声明

数字

**图1。αSyn不抑制哺乳动物细胞中的PLD活性**
将空EGFP载体作为对照（vec）、αSyn或GFP-hPLD2瞬时转染细胞，然后检测PLD活性。一些培养孔用于免疫印迹；代表性结果显示，αSyn和GFP-hPLD2蛋白在**（A）**HEK 293细胞和**（B）**PC12细胞。*第一个面板：*多克隆兔抗GFP抗体（Invitrogen）显示GFP-hPLD2；PC12细胞未转染GFP-hPLD2。*第二个面板：*单克隆小鼠抗αSyn（LB509，Santa Cruz Biotechnology）；*第三个面板：*使用抗GFP抗体可视化EGFP载体控制。第四组：单克隆小鼠抗肌动蛋白（Abcam）用作负荷控制。如图所示，瞬时转染后24小时，检测PLD活性。PLD抑制剂VU0155056（2μM；（27））用作抑制的阳性对照。代表性图像显示自**（C）**HEK 293细胞和**（D）**PC12细胞；PLD产品磷脂酰丁醇的信号用箭头背景带用星号。对三个独立实验的结果进行量化并绘制图表，每个实验一式三份**（E）**和F）图表示平均值+SEM。对每条车道上的磷脂酰丁醇信号进行量化，并通过单向方差分析和Tukey的事后检验对背景数据进行比较。**（E）**HEK 293细胞结果的量化。**，与hPLD2转染细胞相比，p<0.01。**（F）**PC12细胞结果的量化。***，与载体转染细胞相比p<0.001。

**图2。αSyn在无细胞分析中不抑制PLD**
**（A）**在存在或不存在野生型人类αSyn的情况下检测hPLD2a的活性。这些条件之间的差异不显著，而添加VU0155056导致hPLD2a活性显著降低。**（B）**使用或不使用野生型人αSyn检测hPLD1b的活性。这些条件之间的差异并不显著。对于所有这些实验，反应在37°C下孵育30分钟，终止并游离^三通过闪烁计数对H-胆碱的释放进行定量（见实验程序）。如图所示，小分子PLD抑制剂VU0155056（20μM）被用作一些反应中抑制的对照。背景提取值归一化为平均对照值，并通过单向方差分析与Tukey的事后检验进行比较。图表表示来自3个独立实验的平均值+SEM，每个条件的总n=9。***，与每个αSyn浓度的成对比较p<0.001。

**图3。PLD的过度表达不能挽救α-Syn对酵母生长的影响**
**（A）**温度敏感突变的酵母细胞*第14节*(*第14-1秒*)在23°C时正常生长，但在37°C时无法生长，除非它们获得各种“旁路突变”(*第14-1秒*，矢量，37°C）。如前所述（24），αSyn的表达阻止了*第14-1秒*绕过突变体在限制温度下生长(*第14-1秒*，αSyn，37°C）。**（B）**胆碱激酶1基因缺失(*cki1Δ*)，允许*第14-1秒*突变体以PLD依赖的方式在限制温度下生长，而这些细胞中αSyn的表达阻止了这种拯救作用。**（C）**删除*SPO14号机组*(*spo14Δ*)在中*秒14-1/cki1Δ*突变体丧失了在限制温度下生长的能力。函数的过度表达*孢子14*将增长恢复到*第14秒*-/*cki1Δ*/*spo14Δ*细胞**（C）**但无法挽救α-Syn诱导的生长缺陷**（D）**（n=3）

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