Localized Rho GTPase activation regulates RNA dynamics and compartmentalization in tumor cell protrusions

doi:10.1074/jbc.M804014200

.2008年12月12日；283(50):34785-95.

doi:10.1074/jbc。M804014200。 Epub 2008年10月9日。

局部Rho-GTPase激活调节肿瘤细胞突起中的RNA动力学和分区

希瑟·C·斯图亚特¹, 贾宗建, 阿纳特·梅森伯格, 巴拉特·乔希, T迈克尔·安德希尔, 哈基玛·穆克尔斯, 伊凡·纳比

附属公司

PMID： 18845542
预防性维修识别码： PMC3259890型
内政部： 10.1074/jbc。M804014200个

局部Rho-GTPase激活调节肿瘤细胞突起中的RNA动力学和分区

希瑟·C·斯图亚特等。生物化学杂志. 2008.

.2008年12月12日；283(50):34785-95.

doi:10.1074/jbc。M804014200。 Epub 2008年10月9日。

作者

希瑟·C·斯图亚特¹, 贾宗建, 阿纳特·梅森伯格, 巴拉特·乔希, T迈克尔·安德希尔, 哈基玛·穆克尔斯, 伊凡·纳比

附属

¹加拿大不列颠哥伦比亚大学温哥华分校生命科学研究所细胞和生理学系V6T 1Z3。

PMID： 18845542
预防性维修识别码：下午3259890
内政部： 10.1074/jbc。M804014200个

摘要

mRNA转运和局部蛋白翻译与突起的细胞结构域有关，如神经元生长锥，而对蛋白翻译的放松控制与肿瘤的恶性程度有关。我们在这里显示，激活的RhoA（而非Rac1）在MSV-MDCK-INV肿瘤细胞的伪足中富集，并且Rho、Rho激酶（ROCK）和肌球蛋白II调节RNA对这些肿瘤细胞域的微管依赖性靶向。ROCK抑制不影响假足肌动蛋白的周转，但显著降低假足RNA周转的动力学。基因阵列分析表明，所分析的总基因中，7.3%的基因在伪足和细胞体组分之间的差异大于1.6倍。其中，只有13.2%（261个基因）在伪足中富集，表明只有有限数量的总细胞mRNA在肿瘤细胞突起中富集。通过比较肿瘤伪足mRNA队列和富含神经元过程的mRNA队列，确定了由M-Ras和Shp2蛋白磷酸酶表达定义的肿瘤伪足特异性信号网络。通过ROCK抑制将假足Rho/ROCK激活与特定mRNA的局部表达联系起来，M-Ras和Shp2 mRNA的假足表达减少。参与蛋白质翻译和信号传递的mRNA的假足蛋白富集表明，局部mRNA翻译调节不太稳定的信号分子的假足表达以及翻译这些mRNA的细胞机制。假足Rho/ROCK激活可能通过刺激mRNA的假足移位，从而调节局部信号级联的表达，从而影响肿瘤细胞的迁移和转移。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**RhoA在MSV-MDCK-INV伪足中被选择性激活细胞。** A类，用Raichu-Rho或Raichu-Rac转染细胞FRET探头，如图所示。采集CFP通道的荧光图像之前(*预漂白*)以及之后(*后漂白剂*)光漂白在假足或细胞体区域使用515-nm激光的YFP受体，由表示广场在伪彩色图像中。Raichu-Rho或Raichu-Rac的激活取决于平均像素密度的增加漂白区域的CFP发射，在伪彩色中可见高强度区域着色的图像红色和低强度in蓝色。B类，FRET效率的量化假足(蓝色)和细胞体(黑色)显示在中未经处理或处理的Raichu-Rho或Raichu-Rac转染细胞的图表形式20μ米Y27632在成像前1小时或在细胞中与Raichu-Rho和显性活性Rac1质粒共转染(*DA-Rac公司*)（指±S.E。；n个= 3;^*,对< 0.01).C类，MSV-MDCK-INV细胞被镀在1微米孔滤器和Rho在纯化伪足和细胞体中的活化通过鱼藤酮下拉分析组分。活化Rho的密度测定相对于总Rho确定，并以图表形式表示(n个=三；±标准偏差。；^**,对< 0.001).比例尺,20微米。

**图2。**
**假足RNA易位是微管依赖性和ROCK和MSV-MDCK-INV细胞伪足中的MLC2-依赖性。** A类，MSV-MDCK-INV细胞要么未经处理（对照，*CTL公司*); 用岩石处理抑制剂Y27632（20μ米)，肌球蛋白II抑制剂抑制素(7 μ米)或微管解聚剂诺卡唑（2μ米); 或同时使用Y27632和诺卡唑或镇咳素治疗用Syto14和β-肌动蛋白标记RNA如图所示，特异性抗体。这个箭头指向富含肌动蛋白伪足类。B类，伪足病因RNA的存在而得分在所有条件下用Syto14染色(n个> 30; ±S.E。；^*,对< 0.001).比例尺，20微米。

**图3。**
**MSV-MDCK-INV细胞中RNA而非肌动蛋白转换的ROCK依赖性伪足类。** A类，稳定表达pEGFP-actin的MSV-MDCK-INV细胞(β*-肌动蛋白-GFP*)和未转染的MSV-MDCK-INV细胞标记有细胞发酵染料Syto14(*Syto14 RNA*)要么没有得到治疗（对照组）或用Y27632治疗60分钟（+Y27633）。之前对细胞进行成像到光漂白(*预漂白*)，光漂白后立即488-nm激光的伪足区(*漂白剂*)、和90秒光漂白后(*后漂白剂*). 三的代表图实验显示了漂白区的荧光强度随时间的变化(t吨=0对应于光漂白后的立即时间）β-肌动蛋白-GFP(B类)或Syto14标记的RNA(C类). 未经处理单元格（控件）如所示蓝色和Y27632处理的细胞红色。这些值已归一化为预漂白强度。这个流动分数，表示在漂白区域，以及对照细胞和Y27632处理细胞的恢复半衰期以图表形式显示β-actin-GFP(B类)和Syto14 RNA(C类)（指±S.E。；n个= 3;^*,对< 0.01).比例尺，20微米。

**图4。**
**伪足标化mRNA的鉴定。** A类，Affymetrix公司三种细胞制剂mRNA的基因阵列分析（23913个基因）主体(左边)和假足(*正确的*)MSV-MDCK-INV细胞表达上调基因红色和下调基因绿色对数2折0.7列表见补充表S1假足类上调基因和log2折叠2.0上调基因细胞体。B类，基于mRNA上调的分类MSV-MDCK-INV假性足病增加1.6倍以上（log2倍0.7）（表1），mRNA的数量每个类都显示为饼图。C类，mRNA的基因列表MSV-MDCK-INV伪足中上调（补充表S1；261伪足富集基因）与神经元过程（14） 159过程上调基因）通过灵巧路径分析进行分析和比较。这个*黄色线条*指示网络表达式高于阈值对< 0.05. 网络在任一肿瘤中显著表达突起或神经元突起出现，网络组件见补充表S2。

**图5。**
**富含假足蛋白的mRNA和基因的验证和表达产品。** A类，MSV-MDCK-INV细胞为就地杂交的与β-actin、Shp2和纤维连接蛋白和β-肌动蛋白的感觉链（β-actin感觉）。在亮场图像和黑点表明存在DIG尾寡核苷酸与互补mRNA分子结合，在细胞与β-肌动蛋白寡核苷酸杂交。B类,MSV-MDCK-INV细胞就地与寡核苷酸杂交Arp2/3复合物的β-肌动蛋白、纤维连接蛋白、M-Ras、p41蛋白、Shp2和α-合成营养素(*左侧面板*). 或者，MSV-MDCK-INV细胞，未经处理或用20μ米Y27632持续90分钟*在里面原地*与寡核苷酸杂交到β-肌动蛋白、M-Ras和Shp-2(*右侧面板*). DIG标记的mRNA图谱或斑点总数对假足和细胞体进行计数，并计算其平均比率介绍了假足相对于细胞体的DIG标记mRNA图谱每个指示探针的图形形式（平均值±S.E。；n个= 3;^*,对< 0.05;^**,对相对于FN（左）或未处理的细胞（右）＜0.005）。C类,通过以下方法探测MDCK、MSV-MDCK和MSV-MDCK-INV细胞的总细胞裂解物M-Ras、syntrophin和β-actin的蛋白质印迹。D类，裂解物来自检测MSV-MDCK-INV细胞的胞体和伪足中的纤维连接蛋白，M-Ras、合成营养素、线粒体HSP70（mHSP70）和β-肌动蛋白。乐队通过与β-actin相关的密度测定进行定量。(n个= 3;±S。E.公司。；^*,对< 0.01;^**,对< 0.001).

**图6。**
**伪足Rho/ROCK信号、mRNA靶向和局部发送信号。**假足Rho/ROCK激活将增强假足编码信号分子（如M-Ras和Shp2）的mRNA的传递以及定义反馈回路的蛋白质翻译机制通过局部mRNA传递和翻译。

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