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比较研究
.2008年9月8日；3（9）：e3164。
doi:10.1371/journal.pone.0003164。

对人PUF家族蛋白的信使核糖核酸靶点的比较分析表明，与miRNA调节系统存在广泛的相互作用

阿莱西亚·加尔加诺 1, 迈克尔·福勒, 卢卡斯·贾斯基维奇, 亚历山大·卡尼茨, 米哈拉·扎沃兰, 安德烈·P·格伯
附属公司
比较研究

人类PUF家族蛋白mRNA靶点的比较分析表明与miRNA调节系统存在广泛的相互作用

阿莱西亚·加尔加诺等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

RNA结合蛋白调节的mRNA的全基因组鉴定对于揭示转录后基因调控系统至关重要。保守的PUF家族RNA-binding蛋白通过与mRNAs的3'-UTR序列元件结合来抑制转录后基因表达。尽管它们对后生动物的发育和神经发生有着广泛的研究意义，但哺乳动物PUF家族成员的特征尚不明确，mRNA靶点在很大程度上尚不清楚。我们通过回收内源性形成的核糖核蛋白复合物并用DNA微阵列分析相关RNA，系统地鉴定了与两种人类PUF蛋白PUM1和PUM2相关的mRNA。由数百个mRNAs组成的一个很大程度上重叠的集合与同源PUM蛋白重复相关，其中许多编码功能相关蛋白。PUF结合基序在PUM结合信息中高度富集，并通过RNA下拉实验进行验证。此外，PUF基序以及周围序列在PUM结合信息中表现出较高的保守性，而不是未发现相关的转录物，这表明PUM功能可能受到其他结合保守元素的因素的调节。引人注目的是，我们发现PUF基序在预测的miRNA结合位点周围富集，高置信miRNA结合部位在实验确定的PUM1和PUM2靶点的3'-UTR中显著富集，这强烈表明人类PUM蛋白与miRNA调节系统的相互作用。我们的工作表明RBP和miRNA转录后调控系统之间存在广泛的联系，并为破译PUF蛋白调节其靶mRNA的分子机制提供了一个框架。

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数字

图1
图1。与人类PUM蛋白特异相关的mRNA。
行表示根据SAM分析确定的递增FDR排序的唯一转录本。列表示单个实验。色码表示富集程度（绿色-红色对数2比率刻度）。（A） 与PUM1相关的mRNA。显示了三个PUM1蛋白实验和三个模拟实验，均使用染色技术复制品。（B） 与PUM2相关的mRNA。显示了PUM2蛋白的四个实验和三个模拟实验。（C） ●●●●。维恩图表示PUM1和PUM2靶转录物（右）与相应基因（ENSEMBL，左）之间的重叠。
图2
图2。PUM靶点编码作用于癌症相关通路的蛋白质。
mRNAs与PUM1相关的元件用黄色表示，那些由PUM1和PUM2结合的元件用红色表示。包含PUF基序的消息用黑色粗边框表示。（A） 血管生成调节剂。PUM相关信息编码酪氨酸激酶受体fms相关酪氨酸激酶1（FLT1），即血管内皮生长因子受体1、成纤维细胞生长因子受体（FGFR1）和EPH受体B4（EPHB4）及其配体肾上腺素B1（EFNB1）。这些受体及其配体可以触发诱导血管生成的信号。ARAF（v-raf鼠肉瘤3611病毒癌基因同源物）和MAPK1（丝裂原活化蛋白激酶1）是RAS/raf/MAPK通路的一部分，可激活促进血管生成的ETS（E26转化特异序列）家族转录因子。人类PUM蛋白通常以规范（Wnt/ß-catenin）和非规范（Wnt/钙信号和平面细胞极性）通路的信息为靶点：WNT5A（无翼型MMTV整合位点家族，成员5A）激活非规范Wnt信号，从而诱导内皮细胞增殖体外WNT5A被认为可以促进血管生成效应物MMP1（基质金属肽酶1）和TEK（内皮细胞TEK酪氨酸激酶，TIE-2）的表达。PUM1和PUM2通常是由丝氨酸/苏氨酸激酶GSK3A（糖原合成酶激酶3α）组成的“ß-连环蛋白破坏复合物”的靶向成分，后者磷酸化\223»-连环素，标志蛋白质泛素化，并被蛋白酶体快速降解，蛋白酶体是肿瘤抑制因子APC（腺瘤性息肉病大肠杆菌），以及支架蛋白AXIN1。PUM1进一步与编码共因子TCF/LEF1（转录因子/淋巴增强因子结合因子1）的mRNA相关，当ß-catenin进入细胞核时，这些共因子TCF/LEF1被激活。这包括TCF4和TCF7L27（转录因子4和7-like 2），它们刺激与细胞生长调节有关的基因的转录。（B） RAS的激活器和效应器。表皮生长因子受体、衔接蛋白GR的PUM结合信息编码地下二层（生长因子受体结合蛋白2）和SHC1（Src同源性2结构域包含转化蛋白1），在鸟嘌呤核苷酸交换因子SOS（七子）招募后激活Ras蛋白。RAS与ARAF、MAP3K1（丝裂原活化蛋白激酶激酶1）、PIK3CB（磷酸肌醇-3-激酶，催化，β-多肽）和TIAM2（T细胞淋巴瘤侵袭和转移2）特异性相互作用，可以启动蛋白质相互作用级联，进一步激活更特异的信号通路。Raf/MEK/ERK和MEKK/SEK/JNK通路的组成部分被编码有丝分裂原活化蛋白激酶MAPK1和MAPKAPK5（有丝分裂素活化蛋白激酶活化蛋白激酶5）和RPS6AK3（核糖体蛋白S6激酶，多肽3）的PUM1靶点所覆盖。这些途径以通常诱导细胞增殖的转录因子JUN（JUN癌基因）、ATF2（激活转录因子2）和STAT1（信号转导子和转录激活子）为靶点。PI3K介导的（PIK3CB）信号进一步由蛋白激酶B（AKT1，v-akt小鼠胸腺瘤病毒同源物1）激活和磷酸化GSK3A触发。PUM1还靶向TIAM下游的效应器，如GTP-结合蛋白RAC1（ras-related C3 botulinum toxin底物1）和ras同源基因家族成员B、F和J（RHOB、RHOF、RHOJ），它们都是与肌动蛋白细胞骨架重组有关的TIAM/RAC/RHO信号通路的组成部分。RAC效应器PAK2（p21蛋白活化激酶2）参与细胞迁移和侵袭，EXOC2（胞外复合物成分2）在RAL（Ras-related）激活后诱导血管运输。
图3
图3。与人类PUM蛋白相关的RNA一致序列分析。
（A） 与PUM1、PUM2、，果蝇属Pum和酵母Puf3、Puf4和Puf5蛋白。字母的高度表示出现在图案位置的可能性。省略了外观小于10%的核苷酸。（B） PUF共识主题的分布。（C） PUM绑定消息的3′-UTR中PUF基序的数量。（D） 双PUF基序之间的距离出现在3′-UTR中。表示的箱子为50个nts（0-4000个nts距离）和10个nts。（E） PUM1和PUM2靶点之间PUF基序保守性分析。x轴表示位置（相对于PUF基序的中间），y轴表示第页-Wilcoxon检验值确定PUM目标和非目标的保护分数是否来自相同的分布。垂直蓝线绘制在对应PUF图案的位置0。黑色虚线绘制在第页-值为0.05，表示连续的黑线第页-值为0.01，红线位于第页-值为10−5，这是考虑多重测试的显著性阈值。
图4
图4。验证人类PUM mRNA靶点。
在链霉亲和素磁珠上纯化生物素化3′-UTR与表达PUM1-HD-TAP和PUM2-HD-TAB的HeLa S3细胞提取物之间形成的RNA-蛋白复合物，并通过抗PAP抗体的免疫印迹分析监测TAP-PUM-HD的存在。（A） 用PUM1-HD-TAP和PUM2-HD-TAB提取物（车道1）培养指示基因的生物素标记的3′-UTR序列（车道3至8）。使用Rps26 3′-UTR作为阴性对照探针RNA（泳道8/9）。使用INTS2下拉后的上清液显示在通道2中。（B） PUF结合基序的验证。对应于Dll1 3′-UTR的生物素化RNA与PUM1-HD-TAP提取物（通道2）和超过100倍的竞争RNA（R1；AUUGUAAAUA；通道3）或核心基序发生突变的对照RNA（R2；AUACAAAAAUA；通道4）结合。含有野生型（UGU）或突变型（ACA）PUF结合位点的MET 3′-UTR片段显示在车道5和6中。
图5
图5。miRNA结合位点在人类PUM靶点中富集。
（A） 在高置信度miR-30a靶位点附近（上游400个核苷酸）使用Phylogibs模体查找算法识别的模体示例。x轴表示核苷酸在推断基序中的位置，y轴给出该位置的信息得分（位）。每个字母的高度与推断位点排列中特定位置的相应核苷酸的频率成比例。（B） PUM靶点（IPed，红色）和非靶点（非IPed，黑色）的3′UTR中高置信度miRNA位点（每个3′-UTR核苷酸的位点）的密度分布。
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