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.2008年9月；135(17):2981-91.
doi:10.1242/dev.017863。 Epub 2008年7月30日。

小鼠骨形态发生蛋白受体1A的SM22alpha靶向缺失损害心脏和血管发育，并影响器官发生

Nesrine El-Bizri公司 1, 克里斯托夫·吉格纳伯特, 王凌丽（Lingli Wang）, 亚历山大·程, 克林·斯坦库纳斯, 张庆平, Yuji Mishina公司, 玛琳·拉比诺维奇
附属公司

小鼠骨形态发生蛋白受体1A的SM22alpha靶向缺失损害心脏和血管发育，并影响器官发生

Nesrine El-Bizri公司等。 开发. 2008年9月.

摘要

骨形态发生蛋白受体1A（BMPR1A）在肺动脉高压患者肺血管中的表达减弱，但这种异常对功能的影响尚不清楚。我们用SM22alpha-Cre小鼠培育具有表达R26R的Bmpr1a（Bmpr1-flox）loxP等位基因的小鼠，以消融心肌细胞和血管平滑肌细胞（VSMC）中的Bmpr 1a。SM22alpha-Core；R26R；Bmpr1aflox/flox小鼠在胚胎第11天（E11）后不久死亡，出现大量血管和心包出血，大脑发育受损。在E10.5处，SM22alpha-Cre；R26R；Bmpr1aflox/flox胚胎显示与细胞增殖减少相关的心肌变薄。这些胚胎的主动脉和大血管严重扩张，SMC投资受损，这也与增殖减少有关。SM22alpha-Core；R26R；Bmpr1aflox/flox小鼠显示端脑塌陷，与观察到凋亡减少的区域脑微血管清除受损有关。E9.5和E10.5 SM22alpha-Cre中基质金属蛋白酶（MMP）2和9的转录和蛋白水平降低；R26R；Bmpr1aflox/flox胚胎。通过RNA干扰人肺动脉平滑肌细胞来敲低BMPR1A，降低MMP2和MMP9活性，减弱血清诱导的增殖，并损害PDGF-BB定向迁移。MMP2或MMP9的RNA干扰重现了这些异常，支持BMP信号和MMP表达之间的功能性相互作用。在人脑微血管周细胞中，BMPR1A的敲低降低了MMP2活性，BMPR1A或MMP2的敲低都会导致对凋亡的抵抗。因此，通过降低MMP2和/或MMP9活性，Bmpr1a的丢失可以解释血管扩张和脑微血管持续存在，导致大脑中记录的器官发生受损。

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数字

图1
图1
A.小鼠胚胎的基因分型。第2外显子的靶向缺失Bmpr1a型仅在表达Cre公司和鞭子Bmpr1a型基因。SM22α-Cre；Bmpr1a型弗洛克斯/+(（f）/+)和flox/flox公司(飞行/飞行)分别代表floxed基因的杂合小鼠和纯合小鼠。小鼠表达Cre公司或用牙线清洁Bmpr1a型基因代表WT组。任何突变体(飞行/飞行R26R型)或WT（WTR26R型)小鼠表达Cre公司和R26R型该基因表达β-半乳糖苷酶，可用于LacZ染色。B。SM22α-Cre的Cre活性；R26R；Bmpr1a型flox/flox公司胚胎：全贴LacZ染色SM22α-Cre；R26R；Bmpr1a型弗洛克斯/+胚胎在E9.25的心脏（a，星号）和背主动脉（a，箭头）以及E10.5的较小血管和体细胞肌瘤（b，箭头）中显示蓝色染色。C、。SM22α-Cre的表型；R26R；Bmpr1a型flox/flox公司胚胎：与WT相比SM22α-Cre；R26R；Bmpr1a型flox/flox公司突变体（b与a）在E9.5时表现正常，在E10.5时尺寸相对减小（d与c），在E11时，在心脏（星号）、腹部（星号”）以及口腔（箭头）和大脑（箭头）附近（f与e）观察到出血区域。D。SM22α-Cre的百分比；R26R；Bmpr1a型flox/flox公司基因型。每个年龄段的基因型小鼠数量在（）之间。
图2
图2。SM22α-Cre的心脏缺陷；R26R；Bmpr1a型flox/flox公司胚胎
（A） E10.5中全山LacZ染色显示心房（am）和心室（vm）心肌细胞呈蓝色染色（Cre活性），而心内膜细胞（ec）无蓝色染色SM22α-Cre；R26R；Bmpr1a型flox/flox公司胚胎。B是A的放大图。面板C、D、F、G、H和I是WT（C、F、H）的连续横截面SM22α-Cre；R26R；Bmpr1a型flox/flox公司（D，G，I）从可存活的E11胚胎中取相同水平的心脏。H&E染色显示心室壁变薄（蓝色箭头）flox/flox公司变异心脏（D）vs.WT（C）。E表示E10.5-E11 WT（白条）和SM22α-Cre；R26R；Bmpr1a型flox/flox公司突变体（黑色条）。条形代表平均值±标准误差（n=3）*P（P）<0.05。E11的心室部分很少出现细胞凋亡SM22α-Cre；R26R；Bmpr1a型flox/flox公司TUNEL免疫染色法检测突变体（G）和WT（F）。然而，与WT（H，蓝色箭头）相比，在突变心室中观察到的PCNA阳性细胞（棕色）更少。J表示对WT心脏切片中PCNA阳性细胞数占心室细胞总数百分比的数值评估（白色条）flox/flox公司E9.5和E10.5-E11的突变体（黑条）胚胎。条形代表平均值±标准误差（n=3-4）*P（P）<0.05. K和L的显微照片显示E10.5 WT和flox/flox公司(飞行/飞行)变异心脏切片。C、D、H和I中的角视图是较高的放大倍数。RA、RV和LV分别表示右心房和右心室和左心室。EC和IVS分别表示心内膜垫和室间隔。描绘WT及其相应突变体的面板具有相同的放大倍数。A、B、D和I中的棒材=100μm。F-I的放大倍数相同。
图3
图3。SM22α-Cre大血管扩张伴VSMC减少；R26R；Bmpr1a型flox/flox公司胚胎
答：。E10.5胚胎（a，b）的全贴装PECAM染色显示SM22α-Cre；R26R；Bmpr1a型flox/flox公司与WT胚胎相比（d对c，箭头）。面板c和d分别是a和b中框架区域的高放大倍数。腹部大血管扩张，经常相互连接，见于flox/flox公司突变体vs.WT（f vs.e，箭头）。H&E染色横切面显示与WT（g）相比，变异主动脉（H）扩张。在全山LacZ染色突变体（j）和WT（i）胚胎的切片中，发现突变主动脉周围表达蓝色SM22α的VSMC投资不足。截面h和j与克和我分别是。以相同的放大倍数获得描绘WT和突变体的面板。条形图，h和j=100μm。B。α-SM-肌动蛋白染色（棕色）显示SMC对扩张的主动脉壁的投资不足SM22α-Cre；R26R；Bmpr1a型flox/flox公司（b） 与WT（a）。TUNEL染色（蓝色箭头）显示，在扩张的主动脉周围flox/flox公司突变体（d）和WT（c）。然而，扩张主动脉的VSMC和扩张主动脉中相邻的间充质细胞中PCNA染色减少（蓝色箭头）flox/flox公司（f） 对比WT（e）。面板a、c和e与WT胚胎中的b、d和f是相似的连续切片flox/flox公司突变胚胎。面板a-f具有相同的放大倍数。以f为单位的棒材=50μm。（g） E10.5-11 WT（白条）背主动脉血管壁中PCNA阳性占SMC总数百分比的定量SM22α-Cre；R26R；Bmpr1a型flox/flox公司突变体（黑色条）。条形代表平均值±标准误差（n=4）*P（P）<0.05。
图4
图4。SM22α-Cre的脑畸变；R26R；Bmpr1a型flox/flox公司胚胎
答：。E10.5 WT胚胎脑的整体LacZ染色显示前脑呈蓝色染色。B。端脑小泡塌陷和大脑受压SM22α-Cre；R26R；Bmpr1a型flox/flox公司（b，d中的箭头）与E10.5处的WT胚胎（a，c）。面板（e、g、i和k）和（f、h、j和l）分别是WT和突变体头部在c和d中虚线水平的h&e染色横截面。第1、2和3节位于额鼻突水平，第4节位于鼻下颌水平。描绘WT和突变体的面板具有相同的放大倍数。棒材（单位：l）=200μmC、。全贴装PECAM染色显示WT（a，c）端头血管单侧清除，但WT（b，c）的端头血管未清除flox/flox公司E10.5处的压头（b，d）。WT头部的鼻-下颌区（e）的清除明显，而突变型（f）的清除阻力明显。脑切片上的TUNEL染色显示，与WT（h）相比，突变体（g）的凋亡较少。进行TUNEL测定（红色）结合NG2免疫荧光（绿色），在WT脑切片中的NG2阳性区域中未观察到细胞凋亡（i）；然而，突变体（j）的免疫反应性更强。描绘WT的面板与对应的突变体具有相同的放大倍数。以f、h和j为单位的棒材=100μm。使用20倍物镜，E10.5 WT（白条）和SM22α-Cre；R26R；Bmpr1a型flox/flox公司突变体（黑色条）。条形代表平均值±标准误差（n=3 in k，n=3-4 in l）*P（P）<0.05。
图5
图5。SM22α-Cre中MMP-9和MMP-2的衰减；R26R；Bmpr1a型flox/flox公司胚胎
答：。分析可能被SM22α靶向缺失修饰的基因的mRNA表达Bmpr1a。显示的值与18秒通过qRT-PCR。（n=3，其中每个样本包含3-4个胚胎）*P（P）<0.05。B。大鼠主动脉壁MMP-9（b vs.WT in a）和MMP-2（d vs WT in c）蛋白表达降低flox/flox公司胚胎通过免疫荧光。请注意，仅用二级抗体作为阴性对照（e）孵育的WT主动脉部分无免疫反应。在相同的放大倍数下采集面板a-e。e中的棒材=50μm。
图6
图6。RNAi通过降低MMP-9和MMP-2，诱导Bmpr1a的缺失，减弱血管平滑肌细胞（HPASMC）的增殖
A.使用HPASMC条件培养基的明胶酶谱。在条件培养基（左）和密度分析（右）上进行的明胶酶谱显示，SiBmpr1a（SiBr1a，黑条）和SiControl处理的细胞（SiC，白条）中的MMP-9和MMP-2活性对血清（10%FBS）的反应持续6小时。条形代表SiBr1a-proMMP-9、MMP-9，proMMP-2和MMP-2的密度测量值的平均值±标准偏差，并归一化为相应的SiC值（n=3-4）*P（P）<0.05和**P（P）SiBr1a和SiC之间<0.01。B.使用MTT法检测血清对HPASMC增殖的反应。用10%FBS刺激转染的HPASMC 72小时，并通过MTT法评估增殖。条形图表示任意外径的平均值±s.e.m570纳米值标准化为0.1%FBS下SiControl的值。（siMMP-2和/或siMMP-9的n=12，SiControl和siBmpr1a的n=26，来自3个独立实验）。††表示血清刺激与非刺激的比较，以及***P（P）<0.001表示在10%FBS下与SiC的比较。
图7
图7。RNAi诱导的Bmpr1a缺失通过减少MMP-9和MMP-2，损害血管平滑肌细胞（HPASMC）的定向迁移
A.对PDGF-BB的明胶酶谱反应。在条件培养基（左）和密度分析（右）上进行的明胶酶谱显示，SiBmpr1a（SiBr1a，黑条）和SiControl处理的细胞（SiC，白条）对PDGF-BB（20 ng/ml）反应6小时后的MMP-9和MMP-2活性。条形代表标准化为相应SiC值的SiBr1a MMP形式密度测量值的平均值±标准误差。（n=4）**P（P）<0.01和***P（P）<0.001.B.使用改良Boyden腔应对PDGF-BB的迁移。用20 ng/ml PDGF-BB刺激SiC（白条）和SiBr1a（黑条）转染的HPASMC 6小时。条形图表示5-6个不同显微视野中迁移细胞的平均值±标准偏差。（n=4）。†P（P）<0.05表示每个Si和***P（P）<0.001表示SiBr1a和SiC之间的比较。典型的显微照片显示了每种条件下迁移细胞的数量。棒材=100μm。
图8
图8。RNAi诱导的Bmpr1a丢失通过减少MMP-2减弱周细胞凋亡（HBVP）
A.使用HBVP条件培养基进行明胶酶谱分析，以应对血清剥夺。条件培养基的明胶酶谱（顶部）和密度分析（下面），以评估SiBmpr1a（SiBr1a，黑条）与SiControl转染细胞（SiC，白条）中MMP-2的活性。条形代表标准化为相应SiC值的SiBr1a MMP-2形式密度测量值的平均值±s.e.m。（pro的n=7-8，活性MMP-2的n=3-4）*P（P）与SiC相比<0.05。B.用MMP-2 RNAi转染的HBVP中MMP-2活性降低。条件培养基的明胶酶谱（上图）和用SiMMP2转染的HBVP中MMP-2的密度测定值（下图）。条形代表标准化为SiC值（n=4）的SiBr1a MMP-2形式密度测量值的平均值±s.e.m***P（P）<0.001.C.使用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和7检测HBVP对血清剥夺的反应。通过剥夺血清24小时诱导SiC（白条）、SiBr1a和SiMMP-2（黑条）转染HPASMC的细胞凋亡，并通过casapseGlo3&7发光分析进行评估。条形代表任意发光值的平均值±标准偏差（n=6-9）***P（P）<0.001与SiC。
图9
图9。血管平滑肌细胞和周细胞中缺陷BMPRIA信号的示意图
删除Bmpr1a型结果VSMC中MMP-9和MMP-2活性降低，周细胞中MMP-2的活性分别达到增殖和凋亡减少的顶点。
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