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.2008年10月；128(10):2498-507.
doi:10.1038/jid.2008.102。 Epub 2008年6月5日。

E-钙粘蛋白抑制在3D人体皮肤等效物中指导细胞骨架重排和上皮内肿瘤细胞迁移

Addy Alt-Holland公司 1, 尤利娅·沙米斯, 凯萨琳·N·莱利, 特蕾莎·M·德罗切斯, Norbert E Fusenig公司, 伊拉·赫尔曼, 乔纳森·加利克
附属公司

E-钙粘蛋白抑制在3D人体皮肤等效物中指导细胞骨架重排和上皮内肿瘤细胞迁移

Addy Alt-Holland公司等。 投资皮肤病杂志. 2008年10月.

摘要

细胞间粘附丧失、细胞迁移激活和上皮内（IE）肿瘤细胞在皮肤癌进展早期的行为之间的联系尚不清楚。本研究描述了鳞状细胞癌细胞系（HaCaT-II-4）在2D单层培养物和模拟癌前疾病的人类皮肤等效物中E-cadherin抑制后的迁移行为。通过建立一个模拟跨上皮肿瘤细胞迁移的模型，首次在三维组织环境中分析了肿瘤细胞的迁移行为。我们的研究表明，细胞黏附的丧失使单个IE肿瘤细胞在正常角质形成细胞之间迁移成为基质侵袭的先决条件。为了进一步了解这种迁移行为，在2D单层培养中分析了E-cadherin缺陷细胞，发现细胞结构改变，膜突起活性增强，这与环周肌动蛋白组织和非肌肉β肌动蛋白亚型的诱导有关。这些特征与运动性增强和随机的单个细胞迁移有关，以应对刮伤。因此，E-钙粘蛋白介导的粘附丧失导致获得表型特性，从而增强细胞运动，并引导皮肤样组织从癌前向癌的转变。

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利益冲突声明

利益冲突

作者表示没有利益冲突。

数字

图1
图1。细胞-细胞粘附的消失导致E-cadherin缺陷细胞在3D组织中的跨上皮、个体迁移
生长2天后HEK的形态学分析显示，在(一)收缩胶原蛋白凝胶或(d日)AlloDerm公司。通过在HEK层顶部接种β-Gal阳性、E-钙粘蛋白感受态的pBabe-II-4细胞产生的组织(b条)胶原蛋白或(电子)AlloDerm显示基底层和基底上层的有组织结构，以及形态异常的细胞簇（箭头所示）。接种β-Gal阳性、E-cadherin缺乏的H-2K产生的组织d日-HEK层顶部的Ecad-II-4细胞(c（c）)胶原蛋白或(（f）)AlloDerm证明细胞已经迁移到(c（c），箭头）胶原蛋白或(（f），箭头）AlloDerm。虚线表示上皮和下层基质之间的界面。Bar，50µm。用抗β-Gal（绿色）和抗β-catenin（红色）抗体对组织切片进行双重免疫染色。(克,小时)pBabe-II-4细胞局限于上皮的浅层（箭头），β-连环蛋白定位于HEK和pBabe-II-4细胞的细胞-细胞边界(克)胶原蛋白或(小时)AlloDerm公司。(我,j个)H-2K型d日-Ecad-II-4细胞在HEK层（箭头）之间迁移并侵入(我，箭头）胶原蛋白或(j个，箭头）AlloDerm。虽然β-连环蛋白仅限于HEK的细胞-细胞边界，但在H-2K中可以看到β-Gal和β-catenin的细胞质共定位d日-Ecad-II-4细胞（黄色）。虚线表示上皮和下层基质之间的界面。Bar，50µm。
图2
图2。E-cadherin功能的丧失与单细胞散射有关
的相位对比图像(一)E-钙粘蛋白相容性pBabe(b条)H-2K型d日-EcadC25-II-4，以及(c（c）)E-cadherin缺乏H-2Kd日-Ecad-II-4文化。注意pBabe-和H-2K的扇形跛足d日-组织良好的菌落外围的EcadC25-II-4细胞（长箭头和插图）和分散的H-2Kd日-Ecad-II-4细胞显示出广泛的膜褶皱、丝足和回缩纤维（短箭头和插图）。显示了具有代表性的图像。棒材，50µm。
图3
图3。E-钙粘蛋白抑制与刮伤后伤口闭合加速有关在体外
刮伤的相位对比图像(一–c（c）)E-钙粘蛋白相容性pBabe和(d日–（f）)H-2K型d日-EcadC25-II-4培养基(克–我)和E-cadhrein缺乏的H-2Kd日-伤后0、24和48小时进行Ecad-II-4培养。虚线表示伤口间隙的边缘，并显示H-2K中伤口加速闭合d日-Ecad-II-4文化。棒材，200µm。(j个)pBabe（白色），H-2K的伤口闭合百分比d日-EcadDC25（灰色）和H-2Kd日-计算24小时和48小时的Ecad-II-4（黑色）培养物与培养物中伤口间隙的初始宽度相对应。在每个指定的时间点计算开放伤口间隙宽度的平均值±SD。
图4
图4。E-cadherin抑制与细胞独立、定向障碍和快速迁移有关
E-钙粘蛋白补体pBabe-和E-钙黏蛋白缺乏H-2Kd日-Ecad-II-4培养物在盖玻片上生长，并使用相控显微镜成像工作站，通过延时视频显微镜分析细胞对刮伤的反应。显示了指定时间点的典型视频帧。棒材，25µm。(一)伤口边缘的pBabe-II-4细胞显示出极化形态，前缘出现跛足（箭头所示），并显示出集体迁移，同时保持其在单层内的位置。(b条)高能动性H-2Kd日-Ecad-II-4细胞作为单个细胞随机迁移至伤口间隙，并显示出增加的膜突起和收缩纤维（箭头所示）。(c（c）)细胞追踪测量的图形表示显示了伤口边缘四个单个细胞的细胞位置和迁移路径，用彩色星号标记（面板中标记的细胞一和b条)，在实验时间过程中。星号的位置显示pBabe-II-4细胞的定向迁移，并指示H-2K的随机迁移d日-Ecad-II-4细胞。
图5
图5。E-钙粘蛋白功能的丧失与肌动蛋白细胞骨架重排和β肌动蛋白诱导相协调
在盖玻片上培养E-钙粘蛋白竞争性和E-钙化蛋白缺乏细胞，并用指骨样蛋白固定和可视化。的殖民地(一)pBabe和(b条)H-2K型d日-EcadDC25-II-4细胞在相邻细胞（箭头）和偏振光板足（箭头）之间显示出丰富的肌动蛋白应力纤维，而(c（c）)H-2K型d日-Ecad-II-4细胞在丝足和棘突中显示出周向肌动蛋白（箭头）和肌动蛋白（箭头）。显示了具有代表性的显微照片。棒材，50µm。刮取培养物7小时后固定，用指骨样蛋白（红色）和抗β肌动蛋白抗体（绿色）双重染色。(d–f日)伤口边缘细胞和(g–i类)显示了相同细胞的各自免疫荧光图像。(d日和克)pBabe和(电子和小时)H-2K型d日-EcadDC25-II-4细胞在跛足（箭头所示）和短丝状足（插图所示）边缘显示β肌动蛋白。(（f）和我)H-2K型d日-Ecad-II-4细胞在整个细胞、膜突起、细长的丝足和棘突（箭头和插图）中显示出强烈的β-肌动蛋白染色。条形，25µm。(j个)pBabe-，H-2K裂解物等蛋白样品中β肌动蛋白水平的Western blot分析d日-EcadDC25-和H-2Kd日-Ecad-II-4细胞培养（IB:β-actin）。与E-cadherin竞争性细胞相比，E-cadherin-deficient细胞的β-actin表达增加了三倍。显示了所述免疫印迹中β肌动蛋白相对强度的密度测定。GAPDH印迹证实蛋白质载量相等（IB:GAPDH）。显示了五个不同实验的代表性数据。
图6
图6。E-cadherin缺陷肿瘤细胞的跨上皮迁移模型体内-从癌前状态到癌前状态的3D组织
该示意模型提出，在向早期癌细胞侵袭过渡的过程中，上皮细胞中E-钙粘蛋白缺乏的肿瘤细胞会发生不同阶段的迁移。(一)在这个跨上皮迁移模型中，E-cadherin竞争性或E-cadherin-deficient细胞（用红色表示）被接种到分层HEK层上。(b条)当在气液界面生长时，上皮上层的E-cadherin竞争性细胞保持休眠、抑制状态。(c（c）)E-钙粘蛋白缺乏的肿瘤细胞与邻近的正常角质形成细胞分离，在组织内进行跨上皮、单个细胞迁移，并附着在骨髓上，从而创造条件，允许侵袭下伏基质。
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