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.2008年7月；36(12):3916-25.
doi:10.1093/nar/gkn340。 Epub 2008年5月29日。

MyoD、MRF4和肌生成素对肌肉特异性基因调控序列四重结构的差异结合

阿纳特·亚夫 1, 詹妮·什克洛弗, Pnina Weisman-Shomer公司, 孟加拉埃亚尔语, 迈克尔·弗莱
附属公司

MyoD、MRF4和肌生成素对肌肉特异性基因调控序列四重结构的差异结合

阿纳特·亚夫等。 核酸研究. 2008年7月.

摘要

四种肌源性调节因子（MRFs）；MyoD、Myf-5、MRF4和Myogenin直接诱导肌肉组织分化。MRF与E蛋白的异二聚体通过结合其启动子或增强子中的E盒基序d（CANNTG）激活肌肉特异性基因表达。我们之前表明，与MyoD-E47异二聚体对E-box的有利结合相反，同二聚体MyoD优先与肌肉特异性基因调控序列的四倍结构相关。为了了解其他MRF是否具有MyoD的DNA结合偏好，比较了异倍体和同倍体MyoD、MRF4和Myogenin的DNA亲和力。与MyoD类似，MRF4的E47或Myogenin的异二聚体与E-box的结合比四链DNA更紧密。然而，与同二聚体MyoD或MRF4不同，肌生成素同二聚物与四倍体DNA弱相关且无参照性。通过在MyoD和Myogenin之间相互切换基本区域，我们证明了MyoD在确定四链体DNA结合亲和力方面的优势。因此，具有植入的MyoD碱性区的Myogenin与四链体DNA的结合几乎与MyoD一样紧密。然而，移植的肌生成素碱性区并没有降低同二聚体MyoD对四倍体DNA的高亲和力。我们推测，MyoD和Myogenin与肌肉基因启动子中四螺旋结构域的不同相互作用可能会不同地调节其肌生成活性。

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数字

图1。
图1。
同二聚体肌生成素和MRF4优先结合整合素DNA的双分子四倍结构。在分别与0.18或1.0 pmol（5′）的结合条件下培养越来越多的重组肌生成素或MRF4的同型二聚体-32P四联体整合素DNA。用4%非变性聚丙烯酰胺电泳从游离DNA中分离出蛋白结合G′2 DNA。(A类)肌生成素与G′2整合素DNA的结合。显示了延迟的蛋白-G′2整合素DNA复合物以及G′2和G′4形式的游离DNA。(B类)MRF4与G′2整合素DNA的结合。
图2。
图2。
同二聚体肌生成素提高结合G′2整合素DNA的热稳定性。(A类)肌球蛋白结合和游离G′2整合素DNA的热变性。含有每0.18 pmol 5′的反应混合物-32P标记的G′2整合素DNA在含有或不含有饱和数量的重组同二聚体肌生成素的结合条件下孵育。结合反应完成后，将混合物在指示温度下加热10分钟。通过将混合物快速冷却至4°C，并添加0.5%十二烷基硫酸钠，将蛋白质从DNA中剥离，从而终止热变性。用非变性10%聚丙烯酰胺凝胶电泳从G′4 DNA中分离出剩余的G′2整合素DNA，并用荧光成像分析定量其相对含量。图中显示了含有或不含肌生成素的混合物中G′2 DNA的剩余量随温度升高而变化的曲线图。(B类)肌球蛋白结合或游离G′2整合素DNA热变性动力学。剩余G′2 DNA的结合条件、热变性和电泳拆分如（A）所述，但所有混合物在57°C下加热所示的增加时间。图中所示为含有或不含肌生成素的混合物中G′2 DNA的残留量随57°C下时间的增加而变化的曲线图。
图3。
图3。
MRF4同源二聚体与双分子四链整合素DNA的结合比E-box更紧密，但与肌生成素无关。在DNA结合条件下培养恒定量的重组MRF4或肌生成素同源二聚体，增加5′-32P标记的E-box或G'2整合素DNA。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳从游离DNA中分离形成的蛋白质-DNA复合物，并通过磷光体成像分析确定其相对比例（见材料和方法部分）。图中显示了结合DNA与游离DNA的测量比率与蛋白质结合DNA浓度的函数关系的代表性电泳图（插图）和Scatchard图。指示的K（K）d日不同样地的值是由斜率的负倒数得出的。
图4。
图4。
MRF4和肌细胞生成素与E47的异二聚体比G′2四链整合素DNA更紧密地结合E-box。如材料和方法部分所述制备的恒定量的MRF4-E47或Myogenin-E47异二聚体在DNA结合条件下孵育，增加5′-32P标记的E-盒或G′2整合素DNA。蛋白质结合和游离DNA的电泳分辨率和磷光图像分析定量如图5图例所示。所示为结合DNA与游离DNA比率的代表性电泳图（插图）和Scatchard图，作为蛋白质结合DNA浓度的函数。这个K（K）d日每个图的计算值都是从其各自斜率的负倒数中得出的。
图5。
图5。
具有与MyoD和MRF4相同的碱性氨基酸簇的突变Myogenin对G′2整合素DNA保持较低的相对亲和力。为了使肌生成素碱性区中的基本氨基酸簇与MyoD和MRF4的相同，将两个突变R84K和K91R引入pGEX-6P载体中的全长肌生成素cDNA中，详见材料和方法一节。未修饰和突变的肌生成素（mut-Myogenin）重组蛋白与G′2整合素DNA的结合K（K）d日测量了各配合物的值（见材料和方法一节）。(A类)MyoD、MRF4和Myogenin的基本区域。三个保守簇R（右）1,R（右）2和R（右）三三种基本氨基酸中的每一种都被强调。区分肌生成素与MyoD和MRF4的两种氨基酸R84和K91被圈成红色(B类)肌生成素和多肌动蛋白结合四链整合素DNA。在DNA结合条件下以0.18 pmol（5′）孵育相应蛋白的指示增加量-32P标记的G′2整合素DNA和形成的蛋白-DNA复合物通过电泳分离，并按照材料和方法一节中的详细说明进行量化。插图：平均K（K）d日G′2整合素DNA与未修饰或突变肌生成素复合物的值±SD[N个]独立测量。
图6。
图6。
MyoD基本区及其外围结构域主要决定了G′2整合素DNA的高亲和力。对pGEX-6P载体中的MyoD或Myogenin cDNA进行修饰和限制，以去除其基本区域，然后用合成DNA双工体替换这些基本区域，合成DNA双偶体对各自的Myogeni或MyoD基本区域进行交互编码（见材料和方法部分）。表达了具有交换碱基区域的未修饰或蛋白质，以及它们结合5′的能力-32测定P标记的G′2整合素DNA。(A类)MyoD和Myogenin未修饰和基本区域切换嵌合体的方案。移植到MyoD中102–121位的小束与肌生成素碱性区的氨基酸序列相对应(b条毫克)而侧翼插入束（残基99–101和122–126）保持各自的MyoD本地序列。移植到肌生成素中的氨基酸（残基74-93）代表MyoD的基本区域(b条医学博士)而侧翼插入的束（残基71-73和94-98）保留了各自的肌生成素本地序列。(B类)MyoD、Myogenin和Myogenin/MoD与G′2四链整合素DNA的结合b条嵌合蛋白。在DNA结合条件下以0.18 pmol（5′）孵育相应数量的蛋白质-32P标记的G′2整合素DNA和形成的蛋白-DNA复合物通过电泳分离，并按照材料和方法一节中的详细说明进行量化。给出的结果是3-5个独立测量值的平均值±SD。(C)MyoD、Myogenin和MyoD/Myogenin与G′2四链整合素DNA的结合b条嵌合蛋白。MyoD/Myogenin与G′2整合素DNA的结合b条按照上述（B）所述对蛋白质进行分析。结果表示四次独立测定±SD的平均值。未修饰MyoD和Myogenin的结合曲线与（B）中的曲线相同。
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