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.2008年8月；19(8):3221-33.
doi:10.1091/mbc.e08-01-0016。 Epub 2008年5月21日。

膜型基质金属蛋白酶组织无创活性结构机制的分子解剖

李小燕 1, 大田一郎, 宜国雅娜, 法里德·萨贝赫, 史蒂芬·J·维斯
附属公司

膜型基质金属蛋白酶组织无创活性结构机制的分子解剖

李晓燕等。 分子生物学细胞. 2008年8月.

摘要

膜1型基质金属蛋白酶（MT1-MMP）通过以I型胶原或纤维蛋白为主的三维（3-D）细胞外基质（ECM）屏障驱动细胞侵袭，MT1-MMP是一种多功能分子，具有1）结构独特的N末端催化结构域；2） 调控底物识别和构象的C末端血红素结构域；和3）I型跨膜结构域，其细胞溶质尾部控制蛋白酶运输和信号级联。然而，MT1-MMP结构域在体外或体内通过3-D ECM屏障为细胞贩运提供服务，目前基本上仍不明确。在此，我们证明胶原蛋白的侵袭活性并不仅仅局限于MT1-MMP的催化、血红素、跨膜或细胞溶质域序列。事实上，即使是分泌的胶原酶，在缺乏MT1-MMP血红素、跨膜和细胞溶质尾结构域的情况下，如果与细胞表面相连，也支持入侵。相比之下，MT1-MMP支持纤维蛋白侵袭活性的能力与胶原酶溶解潜能不同，或者，它需要MT-MMP催化域和血红素域的特异参与。因此，MT1-MMP的组织侵袭特性出乎意料地嵌入了不同但简约的序列中，这些序列用于将必要的基质降解活性连接到迁移细胞的表面。

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图1。
图1。
MT1-MMP在体内外赋予肿瘤细胞组织无创活性。（A） 将HT-1080细胞与GFP和搅乱（siRNA）、MT1-MMP（siMT1）或MMP-1（siMMP-1）特异性siRNA共转染的内的的一）的份在中的过程，第一次月的可能或3-D I型胶原蛋白凝胶监测侵袭活动（苏木精和伊红[H&E]染色横截面显示在第二行，双头箭头标出胶原蛋白凝胶的上下边界）。插图显示GFP标记的转染剂（绿色）粘附在下面的胶原蛋白膜上（条形，50μm）。胶原蛋白溶解活性通过羟脯氨酸释放进行量化（平均μg±SEM；n=3），而侵袭则表示为每hpf侵袭病灶的数量（在进行3个或更多的单个代表性实验中随机选择的5个横截面的平均值±SEM）。通过RT-PCR（右下）检测每个转染体中MT1-MMP和MMP-1的表达。（B） 用荧光纳米珠（绿色）标记HT1080细胞转染剂，并将其接种在11日龄雏鸡的CAM上。经过三维孵育期后，制备横截面并用H&E（顶行；插图，不含HT-1080细胞的CAM）染色或用核染色4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（蓝色）处理，然后用荧光显微镜检查（底行）。每个图像中显示的虚线表示CAM曲面的轮廓。侵袭被量化为穿过CAM表面的HT1080细胞的数量（3个或更多实验的平均Inv±SEM）和侵袭细胞前沿的平均深度（平均IF±SEM）。棒材，100μm*p<0.01。
图2。
图2。
MT1-MMP介导的胶原蛋白降解调节侵袭性活动。（A） 表达MT1-MMP或MT3-MMP的COS细胞在Fluor-594标记的酸提取野生型或r/r胶原蛋白膜上培养3天。通过共焦激光显微镜观察胶原溶解（左柱；棒状，50μm；插入物，GFP标记的COS转染剂）。或者，将细胞培养在野生型或r/r胶原蛋白的三维凝胶上3 D，并制备H&E染色横截面（右柱；棒，50μm）。双头箭头划定了胶原蛋白凝胶的上下边界。插图显示1×10的细胞表面MT1-MMP蛋白水平6Western blot检测MT1-MMP转染COS细胞（左）相对于HT-1080细胞的转染效率（>80%）。（B） 在BB-94存在下，表达MT1-MMP（MT1）、MT3-MMP（MT3）、催化活性不高的MT1-MMP-E/A（E/A）或MT1-MMP3的细胞的胶原降解和侵袭活性以三个或更多实验的平均羟脯氨酸微克±SEM表示，以及在三个或三个以上的单个代表性实验中，五个随机选择的横截面的侵入性病灶/hfp±SEM的平均数。（C） 在BB-94、MT1-MMP E/A或MT3-MMP存在的情况下，表达MT1-MMP-、MT1-MM的COS细胞侵袭CAM。纳米珠标记的COS细胞发出绿色荧光，而DAPI标记的鸡和COS细胞核显示为蓝色。棒材，100μm。
图3。
图3。
栓系胶原酶模拟MT1-MMP活性。（A） MT1-MMP和MT1/MMP-1示意图CAT公司嵌合体显示了各自蛋白酶的前、催化（CAT）、连接子（LNK）、血红素（PEX）、跨膜（TM）和细胞质（CT）域的位置。嵌合体蛋白中插入MMP-1前体的furin识别序列被显示为RXKR（Arg-X-Lys-Arg）。MT1-MMP和MT1/MMP-1细胞表面表达的Western blot分析CAT公司在表面生物素化和免疫沉淀后进行评估（MT1/MMP-1水平CAT公司是ImageQuant 5.2量化的总重量MT1-MMP的55%）。野生型MT1-MMP的活性和自动降解形式以～60和～43 kDa带迁移（分别用黑色和灰色箭头标记）。MT1/MMP-1CAT公司仅以～56-kDa带的形式出现，与MMP-1催化结构域在MT1-MMP铰链区域（Osenkowski等。, 2005). （B） MT1-MMP-和MT1/MMP-1的细胞周胶原溶解CAT公司–通过共聚焦激光显微镜（bar，50μm）和羟脯氨酸释放分别评估表达COS细胞。胶原蛋白降解结果表示为三个实验的羟脯氨酸平均微克数±SEM。（C和D）I型胶原凝胶受对照、MT1-MMP-或MT1/MMP-1侵袭CAT公司–在没有或存在TIMP-1（2μg/ml）或TIMP-2（2μg/ml）的情况下评估转染COS细胞。H&E染色凝胶的代表性横截面以C（bar，50μm）表示，侵入活性以D表示。结果表示为三个或更多实验的平均值±SEM。（E） 用对照物、MT1-MMP-或MT1/MMP-1培养后CAM横截面的荧光显微照片CAT公司–转染COS细胞3天。结果代表进行的三个或更多实验。棒材，100μm。
图4。
图4。
MT1-MMP介导的胶原酶溶解和侵袭活性的区域依赖性调节。（A） MT1-MMP突变体、ΔIS-2、ΔpolyE、MT1-MMP3示意图HPX公司、MT1ΔPEX和MT1/MMP-1CAT公司ΔPEX。删除的域用符号“⋀”标记，而MT1-MMP、MT3-MMP和MMP-1域分别用白色、灰色和图案着色。将对照组、MT1-MMP-、ΔIS-2-、ΔpolyE、MT1-MT3转染COS细胞HPX公司、MT1ΔPEX或MT1/MMP-1CAT公司ΔPEX表达载体。表面生物素化后，通过Western blot分析测定膜定位的MT1-MMP或MT1-MMP变体的表达水平（顶部；箭头和箭头标记蛋白酶活性形式的位置）。MT1-MMP变体的细胞表面表达水平分别为109%、113%、133%、103%和167%。通过明胶酶谱（底部）监测转染细胞对外源性MMP-2的处理。MMP-2的前活性形式分别用箭头和箭头标记。（B） 转染对照、MT1-MMP、MT1-MT3的COS细胞表达的细胞周胶原蛋白溶解（bar，50μm）或凝胶溶解（insets；bar，50微米）活性的激光共聚焦显微照片HPX公司、MT1ΔPEX或MT1/MMP-1CAT公司ΔPEX表达载体并在37°C下培养。在底部的两个面板中，证实了转染MT1-MMP或MT1ΔPEX的COS细胞在25℃培养时表达的细胞周胶原蛋白溶解活性。（C） 侵袭和胶原蛋白溶解活性被量化为侵袭病灶/hpf（在进行的5个代表性实验中随机选择的5个区域的平均值±SEM）和所述释放的羟脯氨酸微克数（平均值±SEM；n=3）*与MT1相比，p<0.1。（D） 用ΔIS-2-，MT1-MT3进行三维培养后CAM横截面的荧光显微照片HPX公司、MT1ΔPEX或MT1/MMP-1CAT公司ΔPEX转染子。MT1-MMP转染COS细胞的对照值为Inv，20.0±0.4，IF，2.6±0.2（代表3个或更多实验的结果；见图3E）。所示结果代表了所进行的三个或更多实验。棒材，100μm。
图5。
图5。
MT1-MMP粘附于细胞表面并调节蛋白水解活性。（A） 细胞表面MT1-MMP或MT1ΔCT在4°C下用生物素标记，COS细胞加热至37°C 40分钟以允许内化。对每个样本的一等分细胞进行裂解，用链霉亲和素琼脂糖进行免疫沉淀，并用抗MT1-MMP进行免疫印迹，以确定生物素化MT1-MMP（TP）的总池大小。用还原缓冲液洗涤第二等分细胞，进行免疫沉淀和免疫印迹，以确定MT1-MMP（IP）的细胞内池。为了监测内化的MT1-MMP在细胞表面的循环，将剩余的细胞样本在还原缓冲液中清洗（即所有残留的MT1-MMP限制在细胞内池中），然后在37°C下再培养60分钟。然后按照上述方法处理样品，以测定TP和IP。使用ImageQuant5.2对每个样品的相对蛋白质水平进行量化，并将其表示为任意密度单位。在右侧面板中，通过共焦激光显微镜（bar，10μm）观察到MT1-MMP或MT1ΔCT贩运。细胞表面MT1-MMP（HA表位标记）用荧光标记的抗-HA抗体在4°C下标记60分钟，然后在37°C下在TX红色标记的Tf存在下孵育40分钟。细胞被固定，并记录MT1-MMP（绿色）和转铁蛋白（红色）的激光共聚焦图像。虽然几乎所有野生型MT1-MMP都内化在转铁蛋白阳性的腔室中，但MT1ΔCT的大部分局限于细胞表面。（B） HA-标记的MT1-MMP、MT1-MMP-E/A或MT1ΔCT在COS细胞中表达，并在Fluor-594标记的明胶膜上培养。在顶部面板中，通过共焦激光显微镜和荧光标记的抗HA抗体（绿色；棒状，10μm）观察定位于细胞-基质界面的HA表位标记的MT1-MMP。在底部面板中，从盒子区域内拍摄的图像被放大并与焦点退化区域合并。绿色病灶代表位于降解明胶黑洞上的MT1-MMP，而黄色显示点区域则是MT1-MMP-覆盖在完整的明胶基质上。棒材，10μm。（C） 表面生物素化后评估的MT1-MMP缺失突变体和嵌合体的相对细胞表面表达水平分别为wt水平的140和94%。MT1-MT6·GPI嵌合物中出现的双倍体被认为代表蛋白酶的前体形式和成熟形式。对表达野生型MT1-MMP、栓系结构域突变体（MT1ΔCT，MT1-MT6·GPI）、可溶性跨膜缺失MT1-MMP（MT1△TM）和可溶性MT1/MMP-1的COS细胞的侵袭活性进行量化CAT公司（MT1/MMP-1）CAT公司ΔTM）在I型胶原凝胶顶部培养三维培养期。25和2000 ng/ml TIMP-2对表达野生型MT1-MMP或MT1ΔCT的COS细胞的侵袭活性有抑制作用。结果表示为三个或三个以上代表性单个实验的平均值±SEM*p<0.01。（D） MT1-MMP-、MT1ΔCT-或MT1-MT6·GPI转染COS细胞介导的下层胶原降解的典型激光共聚焦图像（bar，50μm）。三维培养期后在CAM系统中评估的体内侵袭活性（底行；棒，100μm）。
图6。
图6。
MT1-MMP依赖性纤溶和纤维蛋白侵袭活性的调节。（A） 转染对照、MT1-MMP、MT1/MMP-1的COS细胞CAT公司，或MT1-MT3HPX公司将表达载体培养在标记有Alexa Fluor-594（红色）的纤维蛋白膜上，以评估下层蛋白水解（代表性激光共焦显微照片显示在顶行）或位于纤维蛋白凝胶顶部，以监测侵入性活动（H&E染色横截面显示在最下面一行，用双头箭头标出纤维蛋白凝胶的上下边界）。（B） 转染对照、MT1-MMP、MT1/MMP-1的COS细胞表达的纤维蛋白侵袭活性CAT公司，MT1ΔPEX，MT1-MT3HPX公司MT1ΔCT和MT1-MT6·GPI表达载体被量化为侵袭性病灶/hpf（在5个进行的单个代表性实验中随机选择的5个区域的平均值±SEM）。棒，50μm*p<0.01。
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  • 分子生物学细胞。19:3179.

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