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.2008年4月28日6:11。
doi:10.1186/1741-7015-6-11。

胶原蛋白密度促进乳腺肿瘤的发生和发展

保罗·普罗旺扎诺 1, 大卫·R·英曼, 凯文·艾利塞里, 贾斯汀·格妮特尔, 龙岩, 柯蒂斯·T·鲁登, 约翰·怀特, 帕特里夏·J·基利
附属公司

胶原蛋白密度促进乳腺肿瘤的发生和发展

保罗·普罗旺扎诺等。 BMC医学. .

摘要

背景：乳房造影致密的乳腺组织是发生乳腺癌的最大风险因素之一。尽管有很强的临床相关性，但乳腺密度与肿瘤发生没有因果关系，这主要是因为还没有研究乳腺组织密度的动物模型。重要的是，乳房高密度区域与基质胶原增加有关。因此，细胞外基质对乳腺癌发展的影响及其潜在的分子机制尚不清楚。

方法：为了研究胶原蛋白密度对乳腺肿瘤形成和进展的影响，我们采用了一种小鼠乳腺组织基质胶原增加的双转基因肿瘤模型。用多光子激光扫描显微镜对活肿瘤组织中的肿瘤和肿瘤基质界面进行成像，以产生多光子激发和内源性荧光团的光谱分辨荧光寿命。利用二次谐波产生成像基质胶原。

结果：在此，我们证明，小鼠乳腺组织中基质胶原的增加显著增加了肿瘤形成，大约增加了三倍（p<0.00001），导致侵袭性表型显著增加，肺转移大约增加三倍（p<0.05）。此外，在重组三维胶原凝胶中培养肿瘤外植体后，在胶原蛋白密集的乳腺组织中产生的肿瘤细胞侵袭性表型增加仍然存在。为了更好地理解这种行为，我们使用非线性光学成像方法对活肿瘤进行成像，以证明基质胶原重组促进了局部侵袭，并且这种行为在胶原密集组织中显著增加。此外，使用多光子荧光和光谱寿命成像，我们确定了黄素腺嘌呤二核苷酸在入侵转移细胞中的代谢特征，其荧光强度和寿命增加。

结论：这项研究提供了第一个将基质胶原增加与乳腺肿瘤形成和转移因果联系起来的数据，并证明在胶原密集的微环境中进展的上皮性肿瘤细胞中出现并持续存在根本性差异。此外，本研究中确定的成像技术和特征可能为快速评估新鲜组织活检提供有用的诊断工具。

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数字

图1
图1
胶原基质密度增加直接促进上皮细胞增殖.（a）肌动蛋白染色显示在低（1.3 mg/ml）和高密度（3.0 mg/ml）胶原凝胶中培养21天的MCF10A人类乳腺上皮细胞（肌动蛋白，绿色；细胞核，蓝色）。左：在低密度基质中形成两个分化良好的腺泡结构。右图：一个没有组织的单一殖民地。（b）高密度基质中培养的乳腺上皮细胞增殖增加，通过增加Ki67抗原（增殖标记物）的检测来测量。
图2
图2
高乳腺胶原密度促进肿瘤形成.（a）10周龄野生型和杂合型Col1a1乳腺组织学研究tmJae公司小鼠表现出与Col1a1相关的基质胶原和高细胞性增加tmJae（tmJae）小鼠模型。比例尺25μm。（b）胶原蛋白密集型（Col1a1）乳腺中每只小鼠的肿瘤数量显著增加。（c）10周龄PyVT/wt和PyVT/Col1a1小鼠第四个腹股沟乳腺的整装制剂。定量分析三对腺体的增生面积，通过ImageJ软件中密度切片的共同阈值集计算得出，与基质胶原增加相关的增生增加了1.5倍以上(t吨-测试：第页= 0.03). 此外，在年龄匹配的时间点，具有致密间质的小鼠肿瘤不仅显示出更多的增生区域，而且还显示出远离腺体的肿瘤区域（箭头（c）和（d））。（e）低(我), (ii（ii）)和高(三), (iv（四）)10周龄小鼠H&E染色组织切片的放大图像显示PyVT/Col1a1肿瘤中胶原增加((ii（ii）)和(iv（四）))与PyVT/wt相比，具有更具侵袭性的表型(我)和(三)肿瘤。标尺50μm in(我)和(ii（ii）)和25μm英寸(三)和(iv（四）).
图3
图3
与致密基质胶原相关的转移增加.（a）与在对照腺体形成肿瘤的小鼠相比，在15周时，在胶原蛋白密集型乳腺（PyVT/Col1a1）形成肿瘤的老鼠的每个肺的肺转移数量增加（PyV/wt；平均值±标准误差（SEM），n个=每个基因型4个）。（b）三维肿瘤细胞侵袭试验显示，来自胶原密集型肿瘤的肿瘤外植体（PyVT/Col1a1）在10天后比来自PyVT/wt肿瘤的外植体更多地侵入三维胶原凝胶并形成集落（平均值±SEM；n个=4 PyVT/wt和n个=来自四只同胞小鼠的14个PyVT/Col1a1肿瘤移植体）。（c）通过以血清为化学引诱剂的跨孔迁移实验（平均值±SEM；n个≥3个独立实验）*表示存在统计显著差异(第页<0.05）以下分析t吨-测试。
图4
图4
肿瘤相关胶原特征.（a） -（c）TACS-1示例。局部致密的胶原蛋白区域（a）靠近（40μm‘以上’）小肿瘤区域（b）这是由于SHG（胶原蛋白）信号强度增加导致肿瘤周围胶原蛋白区域整体增加；（c）三维表面强度图显示TACS-1处的信号大约增加了三倍。（d）,（e）TACS-2的示例，显示拉直（拉紧）的胶原纤维围绕并限制上皮肿瘤体积的扩大。在TACS-2区域，相对于肿瘤边界的纤维角度定量分析[27]显示，纤维在0°左右的分布与肿瘤细胞的非浸润区域相关。（f）TACS-3的示例显示肿瘤细胞侵袭区域的胶原纤维呈放射状排列，由肿瘤细胞重组。在TACS-3区域，相对于肿瘤边界的纤维角度定量分析[27]显示，纤维分布在90°左右，与肿瘤细胞的局部浸润相关。
图5
图5
肿瘤相关胶原特征的进展增加，高胶原密度的局部浸润增加.（a）8周龄正常人TACS-1（野生型(我), (ii（ii）))胶原蛋白密度（col1a1(三), (iv（四）))肿瘤显示与密度相关的更发达的TACS-1（TACS-1和-2之间的早期转换），同时在野生型肿瘤中显示很早的TACS-2形成（用黄色箭头显示；白色箭头表示TACS-1区域，因为它位于焦平面之外，所以没有显示）。显示的肿瘤区域((ii（ii）)和(iv（四）))处于Δz（z）=40μm来自胶原蛋白特征((我)和(三)). 注意，当PyVT/wt(ii（ii）)和PyVT/Col1a1(iv（四）)肿瘤在相同的功率设置下连续成像((ii（ii）)与(iv（四）)). 的代表n个=4对肿瘤。（b）对肿瘤进行成像，并分离MPE（伪彩色红色）和SHG（伪彩色绿色）信号。8周时，肿瘤显示早期TACS-3区域和胶原密集型肿瘤的局部浸润(ii（ii）)而PyVT/wt肿瘤(我)仍主要由胶原蛋白（TACS-2）结合且无损伤。10周时，致密组织中的肿瘤(iv（四）)与对照组织相比，显示了进一步的TACS-3进展区域和侵袭性表型(三)这基本上是非侵入性的，几乎没有胶原蛋白重组。的代表n个每个背景≥6个肿瘤。（c）8周内胶原纤维与肿瘤边界夹角的定量分析(顶部)和10周(底部)老动物。PyVT/wt动物表现出很少的TACS-3，并且主要是非侵入性的，只有23%（8周）和24%（10周）的纤维的角度超出TACS-2分布约0°（即小于-15°或大于15°）。相比之下，PyVT/Col1a1肿瘤侵袭性更强，具有更广泛的纤维分布和TACS-3的某些区域（分布在90°左右），在8周和10周时，46%和51%的纤维分布在TACS-2分布（0°）之外，分别（*表示与TACS-3/侵袭相关的事件数量（75°至105°）显著增加）。从至少6个独立肿瘤的至少185个肿瘤区域计算得出。所有比例尺均为25μm。
图6
图6
乳腺肿瘤的SLIM分析.（a）多光子光谱寿命成像显微镜（SLIM）分析890nm激发产生的内源性荧光发射光谱。发射信号通过16个通道（显示10个通道）上的10 nm光谱步长分离，每个通道中收集的光子用于生成荧光寿命图像，并使用SLIM-Plotter绘制每个通道的信号（显示）。胶原蛋白的发射（在输入波长的一半）显示出一个非常强烈和尖锐的信号，没有明显的衰减（寿命），证实了胶原蛋白信号的SHG性质（上图）。肿瘤和基质细胞内源性荧光的发射光谱表明，唯一实质性的发射信号是在530nm处，表明自体荧光信号的来源是FAD，530通道的寿命值与荧光寿命成像显微镜（FLIM）获得的值相匹配。（b）肿瘤附近基质的多光子强度和FLIM图像（顶部）以及来自野生型肿瘤的肿瘤和基质成分（底部），显示了FLIM对肿瘤细胞、基质细胞和细胞外基质成分成像的效用。注意基质细胞的强度和荧光寿命增加（在（c）中量化），胶原蛋白的寿命较低（匹配系统响应，即没有实际的寿命/蓝色映射）。（b）中的彩色图表示两项模型分量的加权平均值（τ米= (一1τ1+一2τ2)/(一1+一2))使用（c）中所示的方程式。（c）使用所示方程定量分析肿瘤和基质（下标s）细胞的荧光寿命成分。注意基质细胞的第二（长）组分和加权平均组分（见上述等式）与原发肿瘤块中的细胞相比有所增加。请注意，使用4个独立肿瘤的每个肿瘤图像的至少30个测量值来计算原发肿瘤肿块中肿瘤细胞的寿命值，而使用4个单独肿瘤的每个瘤图像的至少6个测量值用于基质细胞*表示具有统计显著性(第页<0.05）采用单因素方差分析（ANOVA）进行差异分析事后的，事后的Tukey-Kramer试验。
图7
图7
侵袭性肿瘤细胞的荧光寿命成像显微镜分析.（a）远离和靠近侵袭性TACS-3区域的细胞的强度和荧光寿命成像显微镜（FLIM）图像显示，侵袭性区域附近的荧光强度和寿命增加（图像左侧）。（b）10周龄PyVT/wt和PyVT/Col1a1动物肿瘤的FLIM图像证实了图5所示的胶原密集型肿瘤TACS-3增加。（c）增加入侵细胞的荧光寿命。与基质细胞一样，侵入细胞中的第二（长）和平均成分增加。然而，与原发肿瘤肿块中的细胞相比，侵入细胞中的短成分也增加了。注意，计算寿命值时使用了原发肿瘤肿瘤肿块内细胞的45个测量值和邻近肿瘤原发瘤肿块的侵入细胞的45次测量值。（d）第二个（长）成分来自原发性肿瘤块内的细胞、侵袭性肿瘤细胞和基质细胞，随着细胞从原发性上皮性肿瘤表型转移到更迁移的表型，该成分逐渐增加*表示具有统计显著性(第页<0.05）采用单因素方差分析（ANOVA）进行差异分析事后的，事后的Tukey-Kramer试验。
图8
图8
基质胶原增加致乳腺上皮性肿瘤进展的模型乳腺基质中纤维胶原的增加直接调节乳腺上皮细胞的三维机械微环境，影响增殖和表型。此外，增加的胶原蛋白促进与成纤维细胞的前馈循环，以促进额外的胶原蛋白沉积，增加基质/成纤维细胞数量，从而增加对乳腺上皮细胞的旁分泌信号。最终结果是上皮细胞增殖/肿瘤形成增加，侵袭性和转移性表型增加。
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